Реферати » Реферати по біології » Секвенирование (Генна інженерія)

Секвенирование (Генна інженерія)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введення ......................................................................................................3
1. Визначення нуклеотидної послідовності модифікованим методом
Максама і Гілберта ....................................................................................................4
2. Секвенирование ДНК методом полимеразного копіювання (метод Сенгера)
............ 8
3. Филогенетический аналіз геномів вірусів ... ................................................... 15
4. Комп'ютерний аналіз генетичних текстів ................................................... ..18
Висновок ................................................................................................ ..22
Список літератури ....................................................................................... .23

ВСТУП .

Розробка методів клонування та визначення послідовності основ (секвенування) нуклеїнових кислот поклала початок новому етапу розвитку молекулярної біології. Знання первинної структури ділянок геному, що виконують певні функції, дало можливість ефективно застосувати для їх дослідження цілий арсенал нових методів генної інженерії.
Ці методи (спрямований мутагенез, рекомбінація in vitro та ін.) Дозволяють модифікувати ділянки нуклеотиднихпослідовностей і досліджувати їх функції на молекулярному рівні. З їх допомогою комбінуються ділянки генетичного матеріалу і створюються геноми з абсолютно новими функціями.

Секвенирование нуклеїнових кислот в даний час стало рутинним методом молекулярної біології. Безсумнівно, в найближчому майбутньому з'являться ще більш досконалі автоматичні секвенатори, що призведе до різкого збільшення числа розшифрованих послідовностей.

Завдяки знанню генетичного коду з'явилася можливість визначати ділянки нуклеотиднихпослідовностей, що кодують потенційні білки.
Це джерело і сьогодні дає нам основну інформацію про функціональне будову нуклеотидноїпослідовності.

1. ВИЗНАЧЕННЯ нуклеотиднихпослідовностей МОДИФІКОВАНИМ МЕТОДОМ

МАКСАМА І Гілберт.

Швидкий прогрес, що спостерігався в останні роки в різних областях молекулярної біології, багато в чому обумовлений появою ефективного методу визначення первинної структури ДНК. Цей метод, запропонований в 1977 р
Максамом і Гилбертом, заснований на селективної хімічної модифікації різних типів гетероциклічних підстав у складі ДНК з наступним розщепленням межнуклеотидной зв'язків в модифікованих ланках. Реакції селективної модифікації по кожному типу гетероциклічних підстав проводяться таким чином, щоб у кожній молекулі ДНК в середньому модифицировалось тільки одна ланка даного типу. Оскільки всі ланки даного типу в складі молекули еквівалентні і реагують з модифицирующим агентом з однаковими швидкостями, то в сумі кожна ланка цього типу виявиться частково модифікованим. Подальша обробка ДНК вторинним аміном або лугом призводить до відщеплення модифікованих гетероциклічних підстав від ланцюга ДНК і розриву полинуклеотидной ланцюга в місцях відщеплення гетероциклов (рис. 1).

Модифікації піддають ДНК, 32Р-мічені по 5'-кінцевого нуклеотидному ланці. Радіоактивна мітка вводиться фосфорилюванням за допомогою-32Р-
АТР і Т4-полінуклеотідкінази. Таким чином, в результаті хімічної деградації виходить набір фрагментів ДНК різної довжини. Довжини цих фрагментів відповідають положенню мономірних ланок того типу, який піддавався модифікації. Кінцева радіоактивна мітка служить точкою відліку при визначенні довжини продуктів хімічної деградації ДНК (рис. 2)

Набір отриманих фрагментів фракціоніруется електрофорезом в ПААГ, який дозволяє розділяти оліго (поли) нуклеотиди, що відрізняються по довжині всього на одне мономерна ланка. Послідовність нуклеотидів в ДНК читається безпосередньо з радіоавтографа гелю.

Метод Максама і Гілберта, розроблений для аналізу первинної структури досить довгих ДНК, застосуємо і для коротких (8 - 16 ланкових) оли-годезоксірібонуклеотідов. Однак у цьому випадку реакції хімічної модифікації проводять в більш жорстких умовах (збільшуючи час і температуру реакції) з метою підвищення ступеня модифікації.

Малюнок 1.1 Відщеплення модифікованих ланок від ланцюга ДНК після обробки вторинним аміном або лугом.

Малюнок 2 Хімічна деградація ДНК.

Набір реакцій, застосовуваних для розщеплення ДНК по мономірним ланкам певного типу досить великий і постійно поповнюється: за залишками гуаніну - обробка диметилсульфатом (рис. 3); за залишками аденіну і гуаніну - апурінізація 50%-ної мурашиної кислотою (по Бартону); за залишками аденіну і цитозину - розщеплення гетероциклічних основ під дією 1,2 н. гідроксиду натрію і по залишках тимідину і цитозину - обробка гидразином (рис. 4).

В даний час широко використовуються два основні варіанти секвенування по Максаму - Гілберту. У першому з них реакції хімічної модифікації ДНК проводять в розчині, а в другому ДНК попередньо иммобилизуют на твердій фазі (наприклад, ДЕАЕ-целюлозі). Перший метод більш традиційний, його численні модифікації з успіхом використовувалися для секвенування фрагментів ДНК різних розмірів, в тому числі олигонуклеотидов. У той же час другий метод має ряд переваг. Він менш трудомісткий і займає менше часу, простіше в освоєнні, дозволяє обійтися мінімальним набором устаткування. В цілому обидва методи забезпечують отримання цілком прийнятних результатів, а вибір одного з них визначається конкретними умовами лабораторії.


Малюнок 3 Реакція селективного розщеплення по залишкам гуаніну


Малюнок 4 Реакція селективного розщеплення по залишкам тимидина і цитозину.

2. секвенування ДНК методом полімеразної КОПІЮВАННЯ.

(МЕТОД Сенгер)

Ферментативний синтез оліго (поли) дезоксірібонуклеотідов за допомогою ДНК-полимераз, що полягає в копіюванні матричного полинуклеотида знайшов блискуче застосування в якості одного з двох найбільш ефективних методів встановлення первинної структури ДНК. Метод полягає в отриманні блоків-копій полідезоксірібонуклеотіда, структура якого вивчається. При цьому обов'язковим є виконання двох умов. По-перше, копіювання повинно проводитися, починаючи з певного мономерного ланки. По-друге, синтез копій слід здійснювати чотири рази, кожен раз зупиняючи його по черзі на якому-небудь одному з чотирьох мономёрних ланок (A, G, С або
Т), інакше кажучи, прагнуть отримати повний набір "комплементаціонно відображених" копій досліджуваного полинуклеотида, утворення яких припинилося в кожному з місць розташування одного з чотирьох мономерних ланок нуклеїнової кислоти. Визначення довжини кожної копії дозволяє встановити положення даного мономерного ланки в ланцюзі досліджуваного полинуклеотида. Довжина копії визначається фракционированием в поліакриламідному гелі. Цей метод, таким чином, так само як і метод, заснований на модифікації підстав дозволяє отримувати інформацію про становище певного мономерного ланки в ланцюзі полинуклеотида прямо після фракціонування.

Для отримання копії досліджуваного полинуклеотида в останньому вибирають точку відліку, що досягається введенням в систему ферментативного синтезу як нуклеозидного компонента олигонуклеотида-затравки. Такий олигонуклеотид у всіх копіях, що утворюються в результаті добудовування його ферментативним шляхом, залишається постійним 5'-кінцевим фрагментом, т. Е. Є точкою відліку. Копіювання за допомогою ДНК-полімерази в присутності всіх чотирьох дезоксирибонуклеозид-5'-пірофосфатів (один з них береться
32Р-міченим) проводять протягом обмеженого часу. Мета цього етапу - проведення статистично обмеженого синтезу для отримання всіх можливих копій, починаючи з затравки, добудованої на одне, два і т. Д. Ланок, і включаючи повну копію досліджуваного полинуклеотида. В ідеалі суміш повинна включати всі можливі полінуклеотіди (рис. 5), синтез яких статистично припиняється десь в середині матричного полинуклеотида в районі ATGCTG матричної послідовності. На практиці різні компоненти суміші присутні в різних кількостях. Якщо таку суміш далі піддати електрофорезу в поліакриламідному гелі в певних умовах, коли швидкість руху пропорційна довжині ланцюга, на електрофореграмме виявляється серія смуг, що представляють різні олігонуклеотиди. Таке фракціонування зазвичай не проводять, хоча воно може використовуватися для контролю на

Малюнок 5 Використання ферментативного синтезу оліго (поли) дезоксірібонуклеотідов для визначення первинної структури ДНК.

Завершальному етапі аналізу. Инкубационную суміш 32Р-мічених олігонуклеотидів різної довжини у вигляді комплексів з матричним полінуклеотидом піддають гель-фільтрації для видалення дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов і аліквоти реакційної суміші реінкубіруют з ДНК-полімеразою в різних умовах. У випадку "мінус-системи" реінкубацію проводять в присутності тільки трьох дезоксирибонуклеозид-5'-три-фосфатів. Наприклад, в «-А-системі» відсутня dATP і кожна копія в суміші добудовується за допомогою ДНК-полімерази до місця, в якому наступним мономірним ланкою повинен бути залишок pdA (тобто
Т в матричному полинуклеотиде). Образующуюся суміш фракционируют за допомогою електрофорезу і виявляють (ауторадіографіческі) обмежена кількість смуг (їх кількість дорівнює кількості Т в матричному полинуклеотиде).
Аналогічно проводять копіювання за відсутності інших субстратів: - dGTP, - dCTP або - dTTP (-G-, - С-і - Т-системи відповідно). Всі чотири ионофореза проводять в поліакриламідномугелі паралельно. Отримані ауторадіограмми дозволяють відразу написати нуклеотидну послідовність, причому читання ланцюга знизу вгору відповідає 5'3'-полярності ланцюга копії. Наприклад, положення самого короткого олигонуклеотида (в "-Т-системі") вказує на те, що наступний за ним по довжині олигонуклеотид закінчується на Т, т. Е. Що проти смуги, розташованої вище (це смуга в - А-системі), слід записати букву Т. Таким же чином записують далі в послідовності букву А (на підставі положення наступного по довжині олигонуклеотида, який опинився в "-А-системі") тощо. д.
Відповідний ділянку ланцюга в матриці читається з урахуванням принципу комплементарності і антипаралельності ланцюгів в комплексі матриця - приманка. Для перевірки цих даних використовують результати аналізу за допомогою
"плюс-системи". В цьому випадку додаткове копіювання (після першого етапу) проводять у присутності ДНК-полімерази, виділеної з бактеріофага
Т4, яка за відсутності субстратів (нуклеозид-5'-трифосфатов) проявляє
3'-екзонуклеазную активність (аналогічну дії ФДЕ зміїної отрути), т. е. отщепляет мононуклеотиди один за іншим з 3'-кінця. У той же час у присутності субстратів її полімеразна активність у багато разів перевершує екзонуклеазную. Так, якщо в реакційній суміші присутній хоча б один дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат (dATP в "+ А-системі"), деградація кожної копії, що утворилася на першій стадії аналізу, проходитиме аж до місця положення А (Т в матриці). В цьому випадку pdA включається багато швидше, ніж видаляється, і, таким чином, накопичуються фрагменти, містять на 3'-кінці ланцюга А. Аналогічно проводять копіювання в присутності тільки dGTP, dCTP або dTTP. Суміші паралельно піддають електрофорезу, як і в попередньому випадку, і отримують ауторадіограмми, з яких відразу зчитується послідовність 5'3'-напрям, зчитується також знизу вгору). З порівняння фореграмме "плюс-" і "мінус-систем" робиться однозначний висновок про нуклеотидноїпослідовності в копіях і,

Сторінки: 1 2 3 4

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар