Реферати » Реферати з біології » Секвенирование (Генна інженерія)

Секвенирование (Генна інженерія)

отже, в матричному полинуклеотиде.

В даний час виділення фрагментів ДНК, створення рекомбінантних генів, а так само пряме секвенування ДНК і кДНК стають загальнодоступними методами завдяки широкому впровадженню ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції). Сутність ПЛР полягає у використанні двох олігонуклеотидів-праймерів , здатних специфічно гибридизоваться з послідовностями нуклеотидів на протилежних кінцях двох ланцюгів ділянки ДНК, в якості затравки для одночасного синтезу комплементарних ланцюгів з протилежних кінців матриці за допомогою термостабільної ДНК-полімерази. У ході повторюваних циклів (температурної денатурації ДНК, відпалу та ензиматичної добудови праймерів) експоненціально збільшується кількість дискретного фрагмента, фланкували послідовностями нуклеотидів, соответсвующих первинної структурі праймерів.

Застосовність методу Сенгера залежить від можливості отримання одноланцюгових копій клонованих ДНК. Для цієї мети можна використовувати вектори на основі бактеріофага М13. Двухцепочечную чужорідну ДНК можна клонувати в двухцепочечной реплікативної формі (РФ) фагової ДНК, при цьому після трансформації в білкову оболонку буде упаковуватися тільки одна з ланцюгів ДНК. У всіх векторах типу М13тр використовуються подібні полілінкерние послідовності, тому для ініціації полімеразної реакцій придатний один і той же універсальний праймер. При ампліфікації суміші генів
(наприклад, сімейства генів) необхідно провести клонування ПЛР-продуктів у векторах типу М13, в результаті кожен фаг буде містити тільки одну вставку. При прямому секвенування суміші генів спостерігається кілька однаково розташованих смуг у різних доріжках гелю. При ампліфікації ж одного гена можна проводити пряме секвенування, не вдаючись до проміжного субклонірованію.

Вибір оптимального праймера для ПЛР залежить від 5 '- і 3'-кінцевих послідовностей амплифицируемого фрагмента ДНК. Крім того, для вбудовування ПЛР-продукту в полілінкерний сайт вектора М13 в 5'-кінець праймерів повинні бути включені відповідні рестрикційні сайти. У цьому випадку ПЛР-ампліфікація з наступною рестриктазами продукту дозволить провести його вбудовування в ДНК М13, рестріцірованную тим же ферментом. У різні кінці амплифицируемого фрагмента краще включати сайти для різних рестриктаз, оскільки це дозволить уникнути відпалу векторної ДНК самої на себе і забезпечить становище клонованої вставки в певній орієнтації
(так зване спрямоване клонування). При підборі праймерів необхідно враховувати такі фактори. а. Слід переконатися в тому, що ампліфіціруемого сімейство генів не містить консервативного внутрішнього рестрикційного сайту, ідентичного сайту, включеному до праймер. б. Після включення рестрикційного сайту 5 '-кінець праймера потрібно подовжити, в іншому випадку рестриктаза НЕ БУДЕ розщеплювати праймер.
Необхідна для кожного ферменту довжина виступаючого ділянки і час рестрикції вказані в каталозі фірми New England BioLabs.

Перед секвенуванням двухцепочечную рекомбінантний ДНК М13 необхідно перевести в одноцепочечную форму. Для цього її вводять шляхом трансформації в компетентні клітини E. сoli. Бляшки, містять одноланцюгові рекомбінантні фаги, необхідно виколоти, наростити в бактеріальної культурі і депротеінізований.

Потім переносять культуру в мікроцентріфужную пробірку на 1,5 мл і центрифугують мікроцентрифузі при 12000 g протягом 5 хвилин. Переносять
1 мл супернатанта (що містить чистий фаг) у другу пробірку на 1,5 мл, додають 200 мкл поліетиленгліколю і інкубують при кімнатній температурі як мінімум 15 хвилин. Збирають фаг центрифугуванням протягом 5 хвилин при
12000 g і відбирають супернатант. Швидко повторюють центрифугування і повністю видаляють всі сліди супернатанта. Потім осаджують ДНК ацетатом натрію, промивають її 70%-ним етанолом і висушують під вакуумом. Розчиняють
ДНК в 30 мкл води. Отримана ДНК являє собою одноцепочечную матрицю для секвенування.

Нижче наведена конкретна методика секвенування:

Матеріали

- 5 х реакційний буфер: 200 мМ трис-HCl, рН 7,5 , 100 мМ MgCl2, 250 мМ NaCl

- Буфер для розведення ферменту: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ ДТТ,
0,5 мг / мл БСА

- 5 х суміш для мічення: по 7,5 мкМ dGTP, dCTP, dTTP

- Суміш для ddG-термінації: по 80 мкМ dGTP , dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddGTP, 50 мМ NaCl

- Суміш для ddA-термінації: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddATP, 50 мМ NaCl

- Суміш для ddC-термінації: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddCTP, 50 мМ NaCl

- Суміш для ddT-термінації: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddTTP, 50 мМ NaCl

- Стоп-розчин: 90% формамід, 20 мМ ЕДТА, 0,05% бромфеноловий синій,
0,05% ксілолціанол

- Універсальний праймер для секвенування - 40 (0,5 пмоль / мкл)

- [35S] dATPS (1 мКи / 37 МБк в 100 мкл) (Amersham, UK; до складу набору не входить)

- 0,1 М ДТТ

Методика

Все реактиви додають за допомогою диспенсера на 2 мкл Hamilton (PB600), з'єднаного з адаптером і шприцом 1710 з газовим затвором. Суміш для мічення попередньо розбавляють в п'ять разів.

1. Для кожної секвенируемой матриці змішують в мікроцен-тріфужной пробірці на 1,5 мл для отримання праймерной суміші 6 мкл води, 1 мкл універсального праймера і 2 мкл реакційного буфера.

2. Розмічають микроплашку Falcon 3911. У верхній її частині наносять номери клонів, а зліва, зверху вниз, - букви TCGA.

3. На дно кожного осередку наносять 2 мкл праймерной суміші, на бічні стінки - по 2 мкл розчину секвенируемой матриці і центрифугують плашку.
Накривають її плівкою Saran ® і кришкою і поміщають у водяну баню з температурою 70 ° С на 5 хв. Охолоджують плашку на столі (за цей час відбувається відпал праймера і ДНК М13).

4. Поки плашка охолоджується, готують суміш для мічення. Для цього в мікроцентріфужную пробірку на 1,5 мл вносять 0,5 мкл 35S-dATP, 1 мкл 0,1 М
ДТТ, 2 мкл розведеної суміші для мічення і 3,5 мкл води.

5. Розмічають полікарбонатну микроплашку Techne 96 ® так само, як перший плашку, і в осередку в ряду "Т" вносять по 2 мкл суміші для ddT-термінації. Аналогічним чином вносять суміш для термінації в осередки інших рядів і поміщають плашку в термостат для мікроплашек з температурою 42 ° С.

6. Після охолодження плашки (п. 3) протягом 30 хв додають до суміші для мічення (для кожної матриці) послідовно 1,77 мкл буфера для розведення ферменту і 0,22 мкл ферменту Sequenase ® II. (Це дозволяє тримати фермент Sequenase ® II поза холодильника мінімальний час.)

7. По 2 мкл цієї суміші наносять на бічну стінку осередків, що містять праймерной суміш, і центрифугують плашку для перемішування компонентів.
Включають секундомір.

8. Через 2 хв починають переносити розчин з осередків першої плашки у відповідні комірки попередньо нагрітій і вміщеній в термостат полікарбонатною плашки. Для цього використовують звичайну мікропіпетку, швидко змінюючи наконечники після кожного осередку (пам'ятаєте, що використані наконечники радіоактивні).

9. Після того як перенесений розчин з останньої клітинки, включають секундомір і в наконечник на шприці Hamilton набирають стоп-розчин.

10. Через 5 хв наносять по 5 мкл стоп-розчину на бічну стінку кожного осередку і центрифугують плашку. Після центрифугування плашку, закриту кришкою, можна зберігати в морозилці до використання (при - 20 ° С
35S-продукти можна зберігати протягом тижня).

Ампліфікувати послідовності нуклеотидів можна побачити в УФ-світлі після фракціонування продуктів ПЛР за допомогою гель-електрофорезу впрісутствіі бромистого етидію. У більшості випадків після ПЛР при наявності
1 - 10 нг ДНК-матриці виявляється тільки одна смуга ДНК очікуваної електрофоретичної рухливості. Чутливість і специфічність детекції продуктів ампліфікації значною збільшуються при використанні різних варіантів ДНК-ДНК-гібридизації з олігонуклеотидами-зондами, мають радіоактивну биотиновой, флюоресцентную або хемолюмінесцентним мітку. Це зробило можливим проведення робіт з мінімально можливою кількістю матеріалу, (наприклад, з однією клітиною, однією копією гена) без попередньої його очистки.

В якості вихідної матриці для ПЛР може бути використана ДНК (або кДНК, отримана за допомогою попередньої зворотної транскрипції РНК), виділена як з свежеполученной клітин і тканин, так і із заморожених, висушених або фіксованих препаратів, мають частково деградовані нуклеїнові кислоти, тобто об'єкти, раніше недоступні для аналізу. Так, за допомогою методів ПЛР була ампліфікувати, клонована і секвенувати ДНК єгипетської мумії, продемонстрована можливість аналізу специфічних ділянок ДНК за наявності одного волоса, клітини, сперматозоїда в цілях ідентифікації особи і статі господаря.

Серповидно-клітинна анемія,-таласемія, діабет, ревматоїдний артрит, м'язова дистрофія, фенілкетонурія, гемофілія, дефіцит - антитрипсину - ось далеко не повний список генетичних захворювань, які можуть бути виявлені на ранніх стадіях розвитку ембріона за допомогою
ПЛР Розроблено також підходи до раннього виявлення і прогнозування онкологічних захворювань.

3. ФІЛОГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗУ геном вірусу.

Филогенетический аналіз молекулярних даних є одним з підходів до теоретичного вивчення структури і функції генетичних макромолекул (РНК, ДНК, білків) та їх еволюційного перетворення. Основна мета філогенетичного аналізу - вивчення еволюційного порядку дивергенції послідовностей генів і білків або їх частин, а також відновлення списків еволюційних подій (замін нуклеотидів, делеций і вставок) в предкових лініях цих макромолекул.

Основним інструментом філогенетичного аналізу є порівняння близьких

Сторінки: 1 2 3 4

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар