Реферати » Реферати по біології » Секвенирование (Генна інженерія)

Секвенирование (Генна інженерія)

щодо структури або по функції генів або білків, і перш за все, порівняння їх первинних послідовностей.

Найважливішим властивістю функціонально значимих структур макромолекул є їх еволюційний консерватизм. Чим менше функціональна важливість окремих ділянок генів, тим більше вони мають тенденцію до еволюційної мінливості. Так, наприклад, псевдогени мабуть повністю втратили функціональну активність. Для них характерно швидке накопичення в ході еволюції різних замін, делеций і вставок, що руйнують вихідну структуру гена. З іншого боку, гістони Н4, які відіграють важливу роль в упаковці хроматину, майже не змінювалися протягом усього еволюції тварин.

Консервативність генів дозволяє виявити віддалене спорідненість між їх представниками, давно разошедшимися в ході еволюції і які виконують іноді різні функції. Однак для філогенетичного аналізу необхідно і наявність певного рівня мінливості генів. Мутації, делеции і вставки є свого роду мітками, завдяки яким вдається відновити шляху еволюції сучасних форм макромолекул. Гени з різною величиною консервативності придатні для вивчення різних еволюційних рівнів. Сильно консервативні гени та їх продукти (гістони, тРНК) не можна, наприклад, використовувати для дослідження еволюції загонів і дрібніших таксонів, але з успіхом можна застосовувати для вивчення еволюції більш великих таксонів.
Сильно варіабельні гени, навпаки, дають хороше дозвіл лише на пізніх еволюційних етапах.

Останнім часом метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з наступним аналізом нуклеотидної послідовності широко використовується для точної ідентифікації вірусів і визначення їх спорідненості щодо інших штамів. Для порівняльної характеристики геномів різних штамів вірусів також проводять рестрикційний аналіз ПЦР-продуктів. Зазвичай для побудови філогенетичного дерева використовуються дані послідовностей нуклеїнових кислот. Філіпченкове дерево дуже ясно показує спорідненість між вірусами, якщо аналізується велика кількість ізолятів. Для цих цілей існує багато комп'ютерних програм. Найбільш популярні пакети программ-PHYLIP (PHYLogeny Inference Package), PAUP (Phylogentic Analysis
Using Parsimong), CLUSTAL і MEGA.

Для філогенетичного аналізу особливо цікаві РНК-віруси, які існують як гетерогенні популяції. Їх геном більш генетично пластичний, ніж геном ДНК-вірусів.

Так, геном вірусу сказу, який відноситься до роду Lyssavirus сімейства Rhabdoviridae, представлений одноцепочечной негативної РНК довжиною близько 12 000 пар основ (п.о), яка кодує п'ять основних білків.

Білки поділяються на три функціональні групи: оболонкові
(G, M) нуклеокапсідний (N) і РНК-полімеразної комплекс, що складається з L і NS білків. Білки N, NS і L разом з віріонної РНК утворюють нуклеокапсид, який оточений мембраною, яка містить трансмембранний глікопротеїн G, відповідальний за антигенні властивості вірусу. Існування псевдогена (між G і L цистрона, є відмінною особливістю вірусу сказу від вірусу везикулярного стоматиту.

N-ген лиссавирусов, як показало клонування і секвенування, є найбільш консервативним за своєю структурою з усіх генів вірусу сказу .

Mannen K.et al, в 1991 р визначили велику залежність відмінностей у N-гені від географічної локалізації, ніж від хазяйської специфічності. В Онтаріо вірус сказу, який описаний як єдиний
«Арктичний» тип, розділили на чотири основні типи. Ці типи філогенетічеськи розгалужуються на дві основні гілки, одна з яких состовляет один тип, друга три основних типи, що відображає історичне пересування вірусу в регіоні від середини до кінця 50-х рр. Епізоотія пересувалася на південь Онтаріо з півночі і Квебека. Зміни в послідовності N-гена, визначених для 4-х вірусних типів, можуть представляти генетичний маркер для більш суттєвих змін в інших частинах вірусного генома.

Kissi et al представили перше порівняння між генотипами і молекулярними відмінностями N-гена всередині першого генотипу. Филогенетический аналіз гена нуклеопротеина 82-х лиссавирусов підтвердив існування шести генотипів лиссавирусов, і також виділив ізоляти сказу першого генотипу в окремі генетичні лінії. Ізоляти з меншою ніж 80% нуклеотидной і
92% амінокислотної гомологією відносяться до різних генотипам. Два коротких регіону з 400 нуклеотидів, які кодують аміноконец N-протеїну, і 93 нуклеотиду, що кодують N-NS-регіон, можуть бути використані для визначення географічного розподілу основних вірусних ліній. Виявлено два регіони, які мають найменший рівень гомології: ділянку довжиною 199 пар основ (нуклеотиди від 1080-го до 1278-го) і більш протяжний фрагмент, розташований між 99-м і 405-м нуклеотидами. Філіпченкове дерево побудували, використовуючи пакет програм MEGA. З їх допомогою отримали дерево з гілками, делящимися на 6 кластерів, які відповідають 6-ти генотипам.
Порівняння ізолятів показало, що в генетичному плані найбільш близькими виявилися 4-й і 5-й генотипи, у яких рівень відмінностей становив 79,8%
(нуклеотідний рівень ) і 93,3% (амінокислотний рівень) [Duvenhage virus
(4) і EBL1 (5)]. Усередині генотипу 1 найменше подібність серед ізолятів з
Азії та Латинської Америки - 83,3%; і найбільшу схожість в изолятах з
Африки і Латинської Америки - 92,2%.

Филогенетический аналіз ізолятів 1-го генотипу вірусу сказу.

Kissi et al. ідентифікували 11 филогенетических ліній, узятих відповідно до їх географічним походженням і видом господаря: Африка
1а, Африка 1в, Африка 2, Африка 3, Азія, Арктика, Європа / Близький Схід,
Латинська Америка 1 і 2 та дві групи вакцинних штамів. Філіпченкове дерево будувалося на підставі порівняння фрагмента або цілого N-гена.

Цей аналіз дозволив точніше визначити циркуляцію по зонам і встановити походження і поширення сказу для деяких ліній, які, можливо, сталися незалежно на цьому континенті від різних попередників. Хоча циркуляція африканських вірусів 1а і 1в більш відмінно від вірусів, поширених в Європі і Середньому Сході, проте була виявлена ??генетична зв'язок між ними, що свідчить про загальний предка.

З'ясовано, що накопичення більшості нейтральних мутацій в географічно розділених вірусних популяціях призвело до значних розбіжностей в нуклеотидноїпослідовності гена нуклеопротеина.

При дослідженні гена нуклеопротеина 11-ти вірусів сказу японськими вченими було виявлено 9 окремих кластерів по гомології менш
90% регіону N-гена. Тим самим вони підтвердили дані філогенетичного аналізу, отримані Kissi et al.

Таким чином, варіанти вірусу сказу, згруповані відповідно до їх географічним розподілом, можуть бути використані для дослідження еволюційного розвитку вірусу сказу.

Принципи та методи ОТ-ПЦР.

Зворотно-транскріптазная ПЛР складається з двох етапів:

1-синтез комплементарної ДНК за допомогою ферменту зворотної транскриптази і затравки

2- ампліфікація гена або його фрагментів за допомогою ферменту термостабильной ДНК-полімерази і коротких олігонуклеотидних 20-30-членних затравок (праймерів), комплементарних 3'-кінцевим послідовностям антіпаралельних ланцюгів ДНК гена. Повторюючи стадії денатурації, відпалу праймерів і полімеризації (добудова праймерів)

30-35 разів за 2-3 години отримують мільйони копій специфічної ділянки геному вірусів і бактерій.

Аналіз ПЛР-продуктів.

Аліквоти ПЛР-продуктів розрізають відповідними ферментами і поділяють в 1%-м агарозному гелі. Облік результатів проводять за розміром ПЦР-продуктів за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. На підставі розмірів і відстаней пробігів маркерних ДНК обчислюють розміри досліджуваних фрагментів
ДНК.

4. КОМП'ЮТЕРНИЙ АНАЛІЗ ГЕНЕТИЧНИХ ТЕКСТІВ.

Виявлення та аналіз закодованих в послідовностях функціональних сигналів вимагає застосування сучасних методів інформатики - якісних баз даних з сучасними засобами управління, новітніх методів розпізнавання образів, статистичних досліджень, застосування спеціальних алгоритмів для подолання виникаючих обчислювальних труднощів.

В даний час дослідження функціональних властивостей розшифрованих послідовностей нуклеїнових кислот - це новий розділ молекулярної біології, що межує з інформатикою, з одного боку, та молекулярної біофізики - з іншого. Можна з упевненістю сказати, що в даний час аналіз послідовності биополимера дозволяє витягти лише дуже невелику частку закодованої в ній інформації. В кінцевому рахунку точне виявлення функціональних особливостей в послідовностях нуклеїнових кислот буде можливо тільки після детального дослідження відповідних реакцій, здійснюваних нуклеіновобелковимі комплексами.

Для оперативної роботи з послідовностями створюються спеціальні банки даних. У банку в доступному для користувача вигляді зберігається кожна розшифрована послідовність і її паспорт, в якому зазначені різні відомості про неї. Це відомості про організм, з якого виділена послідовність, про документ, де вона описана, про розташування на ній регуляторних ділянок та білках, які вона кодує і т.д. В даний час створені три великі бази даних послідовностей нуклеїнових кислот: "Genbank" (Лос-Аламос, США - більше 30 млн. Нуклеотидів), база даних нуклеотиднихпослідовностей Європейської молекулярно-біологічної лабораторії (EMBL, Гейдельберг, ФРН - понад 30 млн. Нуклеотидів ) і "Генекспресс" (СРСР, ВИНИТИ-ИМГ АН СРСР - більше 11 млн. нуклеотидів). Відомі також кілька білкових баз даних, найбільш представницької з якої є MBRF-PIR (США). Ці бази даних поширюються на різних носіях - магнітних стрічках і дисках, на оптичних дисках.

Крім побудови філогенетичних древ геномів вірусів комп'ютерний аналіз застосовується при пошуку гомологий, розпізнаванні кодують областей, функціональних сигналів, фізичному (рестрикційних) картуванні молекул
ДНК і для передбачення вторинних структур РНК.

Зараз у світі створено велику кількість програм (зазвичай організованих в пакети), призначених для аналізу послідовностей нуклеїнових кислот і избавляющих дослідників від багатьох трудомістких рутинних операцій, в тому числі: підрахунок числа моно-, ди - і трінуклеотідамі, переклад нуклеотидноїпослідовності в аминокислотную і т.д.

Всі програми умовно діляться на два класи: загального призначення та спеціального. Перші здійснюють ряд_ найбільш поширених операцій по збору та аналізу послідовностей і дозволяють: вводити і редагувати нові послідовності, зчитувати за допомогою скануючих пристроїв інформацію безпосередньо з автографів або гелів ', знаходити ділянки впізнавання ендонуклеаз рестрикції і

Сторінки: 1 2 3 4

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар