Головна
Реферати » Реферати по біології » Атф індуковане зміна внутрішньоклітинної концентрації кальцію в нейронах неокортексу щурів

Атф індуковане зміна внутрішньоклітинної концентрації кальцію в нейронах неокортексу щурів

МІНІСТЕРСТВО ВИЩОЇ І СЕРЕДНЬОГО СПЕЦІАЛЬНОГО ОСВІТИ РОСІЇ


МОСКОВСЬКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО ЧЕРВОНОГО ПРАПОРА ФІЗИКО-ТЕХНІЧНИЙ ІНСТИТУТ

ДІПЛОМНАџЯ РОБОТА

АТФ індуковане зміна внутрішньоклітинної концентрації кальцію в нейронах неокортексу щурів.

НАУКОВИЙ КЕРІВНИК академік Магура І.С.
КОНСУЛЬТАНТ до. Б. н. Войтенко Н.В. рецензент к.б.н. Ісаєв Д
дипломників Кругліков І.А.

Москва 1998

Зміст

1. ВСТУП 4


2. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 5

2.1 Гомеостаз кальцію в нервових клітинах 5

2.1.1 Кальцієві канали плазматичної мембрани 5

2.1.2 Кальцієві буфери 7

2.1.3 Кальцієві канали ендоплазматичного ретикулума 8

2.1.4 Кальцієві насоси 11

2.1.5 Кальцієві обмінники 13

2.1.6 Са2 +-зв'язуючим органели 13
2.2 ВліЯяніе АТФ на кальцієвий гомеостаз 14

2.2.1 Будова і властивості АТФ 15

2.2.2 Номенклатура і субклассіфікація пуринорецепторов. 16

2.2.3 Р1 пурінорецептори. 16

2.2.4 Р2 пурінорецептори 17

2.2.5 Перекласифікація пуринорецепторов. 20

3. ОБ'ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ 21

3.1 Підготовка препарату 21
3.2 Характеристики кальцієвого зонда 22
3.3 Забарвлення зрізів флуоресцентним барвником 24
3.4 Структура експериментальної установки дляя двох-хвильового виміру концентрації кальцію 24
3.5 Розчини й зміна розчинів 27

4. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ 28


5. ОБГОВОРЕННЯ 39


6. ВИСНОВКИ 41


7. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 42

ВСТУП

Молекула АТФ давно відома як повсюдно поширений джерело енергії для внутрішньоклітинного метаболізму. Але її властивості як нейротрансмитера були виявлені порівняно недавно. Сьогодні вже не залишилося жодних сумнівів, що АТФ є нейротрансмитером в автономних нейром'язових з'єднаннях, гангліях і центральній нервовій системі. Приміром, було показано, що АТФ залучена в генерацію больових сигналів через Р2Х1 і Р2Х2 рецептори. Однак роль і розподіл пуринорецепторов в корі головного мозку і особливо в моторній корі досі залишається слабо вивченою. Тому вивчення механізмів дії АТФ в корі головного мозку представляє безперечний інтерес. Ми вивчали дію АТФ за допомогою вимірювання концентрації внутрішньоклітинного кальцію, - одного з найбільш важливих і універсальних регуляторів клітинних функцій.

Мета роботи полягала у вивченні механізмів генерації АТФ - індукованих внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів в нервових клітинах моторної кори.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ


1 Гомеостаз кальцію в нервових клітинах

Концентрація цитозольного кальцію в еукаріотичних клітинах регулюється трансмембраним транспортом і цитоплазматическим зв'язуванням кальцію. Рух іонів кальцію через мембрану контролюється: 1) двома сімействами Са2 + каналів, як то: кальцієвими каналами плазмалемми і кальцієвими каналами, розташованими в мембрані ендо (сарко) плазматичного ретикулуму (ЕР або СР), які формують шляху входу кальцію в цитоплазму;
2) висновком кальцію з цитоплазми завдяки активності кальцієвих насосів плазмалемми та / або кальцієвих обмінників; і 3) акумуляцією іонів кальцію внутрішньоклітинними кальцієвими депо і мітохондріями. Останні служать системами кальцієвого буфера, здатними акумулювати й накопичувати іони кальцію, підтримуючи таким чином гомеостаз кальцію в цитоплазмі.

1 Кальцієві канали плазматичної мембрани

Нервові клітини експресують різні типи кальцієвих каналів плазмалемми, які можуть бути активовані різними впливами.
Грунтуючись на механізми активації, кальцієві канали можуть бути розділені на кілька типів потенціал - керованих і рецептор - керованих каналів.

Потенціал - керовані канали вносять істотний внесок як в регуляцію входу кальцію в цитоплазму, так і в нейрональне електрогенез.
Білки, що утворюють кальцієві канали, складаються з 5 субоедениц (a1, a2, b, g, d). Головна субоедениц a1 формує власне канал і містить місця зв'язування для різних модуляторів кальцієвих каналів. Було виявлено кілька структурно різних a1 субоедениц кальцієвих каналів в нервових клітинах ссавців (позначених як A, B, C, D і E). Функціонально кальцієві канали різних типів відрізняються один від одного активацією, кінетикою, провідністю одиночного каналу і фармакологією. В нервових клітинах описано до 6 типів потенціал - керованих кальцієвих каналів (T-,
L-, N-, P-, Q-, R-канали). Активність потенціал - керованих каналів плазмалемми регулюється різними внутрішньоклітинними вторинними посередниками і мембранозв'язаних G-білками (33,26).

Другий важливий шлях потоку іонів кальцію через мембрану пов'язаний з активацією агонист - керованих каналів. Багато агонист - керовані канали мають значної кальцієвої проникністю при фізіологічних умовах. Таку кальцієву проникність виявляють нейрональні ацетилхолін (Ach)-керовані, глутамат-керовані (NMDA і AMPA / каїнатом типи) і пурінорецептори (10,18,49,34). Крім кальцієвих каналів плазмалемми, керованих зовнішніми впливами, в еукаріотичних клітинах було відкрито також кілька типів кальцієвих каналів, контрольованих внутрішньоклітинними вторинними посередниками. Зокрема, IP3-керовані кальцієві канали були виявлені в нейронах Пуркіньє мозочка (34), а IP4-керовані кальцієві канали - в клітинах ендотелію (35).

Третій, недавно виявлений, особливий тип Са2 + каналів, який контролюється заполненностью внутрішньоклітинних кальцієвих депо, здійснюючи таким чином прямий зв'язок між звільненням Са2 + в цитоплазму з депо і вхід у неї Са2 + через плазмалемму.

2 Кальцієві буфери

Більшість іонів Са2 +, що входять в клітину, практично негайно зв'язується цитоплазматическими місцями зв'язування кальцію. Показано, що тільки менше 1% іонів кальцію, які проникають в цитозоль, залишається в незв'язаному стані (11). Цитозольні кальцієві буфери представлені головним чином Са2 +-зв'язуючим білками, такими як парвальбумін, кальмодулін, тропонин-С, кальретінін, кальціунеурін, білок S-100 (25).
Крім того, цитозольні буферна ємність може бути опосередкована АТФ, яка здатна зв'язувати значну кількість Са2 + (64). 20-50% цитозольних кальцієвих буферів можуть бути видалені з цитоплазми при перфузірованіі клітини, що показує їх мобільність, в той час як решта Са2 +-зв'язуючим ємності відноситься до фіксованих буферам. Мобільні кальцієві буфери можуть відігравати важливу функціональну роль, сприяючи дифузії іонів Са2 + в цитоплазмі та поширенню Са2 + сигналу по клітці. Внутрішньоклітинний введення ендогенних Са2 + буферів
(кальбіндіна D28k і парвальбуміна) через микропипетку призводило до збільшення швидкості наростання [Ca2 +] i на кілька порядків і суттєво впливало на кінетику зміни [Ca2 +] i, що підтверджує роль мобільних Са2 + буферів з низькою молекулярною вагою в ефективному регулюванні внутрішньоклітинної концентрації кальцію.

3 Кальцієві канали ендоплазматичного ретикулума

Са2 + канали ЕР є олігометріческімі протеїнами, вбудованими в мембрану ЕР. Ці канали можна відносно легко виділити з клітини для подальшого структурного аналізу завдяки тому, що білки каналу зв'язуються специфічно і з високою спорідненістю з IP3 (для IP3-керованих каналів) і з ріанодіном (для Са2 +-Керувати каналів).

Са2 +-керовані Са2 + канали ЕР. Ці кальцієві канали були вперше виділені з скелетних і серцевих м'язів. Виявилося, що Са2 + канали ЕР в цих м'язових тканинах мають молекулярні відмінності і закодовані різними генами. Са2 + канали ЕР в серцевих м'язах безпосередньо пов'язані з високопороговимі Са2 + каналами плазмалемми (L-тип) через кальційзв'язуючий білки, утворюючи, таким чином, функціонально активну структуру - «тріаду» .
В скелетних м'язах деполяризация плазмалемми прямо активує звільнення
Са2 + з саркоплазматичного ретикулума завдяки тому, що Са2 + канали плазмалемми служать потенціал - чутливими передавачами активирующего сигналу безпосередньо Са2 + каналам ЕР через котрі пов'язують білки (44). Таким чином, Са2 + депо скелетних м'язів володіють механізмом звільнення Са2 +, викликуваним деполяризацией (RyR1-тип). На відміну від скелетних м'язів, саркоплазматическим Са2 + канали кардіоміоцитів не пов'язані з плазмалеммой, і для стимуляції звільнення Са2 + з депо потрібне збільшення концентрації цитозольного кальцію (RyR2-тип). ДНК, що кодує білки двох типів каналів
Са2 + звільнення, була клонована з тканин людини та кролика, що дало можливість експресувати Са2 +-керовані Са2 + канали в модельні клітинні системи. Білки, вбудовані в ліпідний бішар, формують чутливі до ріанодіну канали, що активуються іонами Са2 + (50 нмоль / л) в присутності АТФ (29). Крім цих двох типів Са2 +-актівіруемих Са2 + каналів, недавно був ідентифікований третій тип Са2 + каналів ЕР (RyR3-тип), який є продуктом іншого гена. Цей третій тип Са2 + каналів ЕР, як було показано, не чутливий до кофеїну (21). Експерименти, проведені на нервових тканинах, продемонстрували присутність всіх трьох типів Са2 + - керованих Са2 + каналів ЕР у мозку ссавців, проте RyR2-тип є домінантним (38). Са2 +-керовані Са2 + канали ЕР є гомотетрамерамі, що складаються з мономерів з молекулярною вагою 500 КД (39)

IP3-керовані Са2 + канали ЕР. Існування IP3-керованих Са2 + каналів вперше було виявлено в нейронах Пуркіньє. Пізніше було показано, що вони вбудовані в мембрану ЕПР. Структура IP3-керованих Са2 + каналів подібна зі структурою Са2 +-Керувати Са2 + каналів
ЕР. Вони також є гомотетрамерамі з молекулярною вагою мономера 260
КД. 50% цих каналів активується 15 мкмоль / л IP3 і блокується рутенієм червоним і La3 +. IP3-керовані Са2 + канали були виділені з мозку ссавців, і їх амінокислотна послідовність була розшифрована.
Було показано, що сімейство генів, експресуються IP3-керовані Са2 + канали, складається з трьох або чотирьох різних генів; вони характеризуються різною чутливістю до IP3 і по-різному розподілені в мозку ссавців (45). Поріг активації цих каналів варіює між 0.2 - 0.5 мкмоль / л в нейронах Пуркіньє мозочка і зростає до 9 мкмоль / л в астроцитах.

4 Кальцієві насоси

Існує два сімейства Са2 + насосів, відповідальних за усунення іонів Са2 + з цитоплазми: Са2 + насоси плазмалемми і Са2 + насоси ЕПР. Хоча вони відносяться до одного сімейства білків (так званому P-класу АТФ-аз), ці насоси виявляють деякі відмінності в будові, функціональної активності та фармакології.

Кальцієвий насос плазмалемми. Са2 + насос плазмалемми, який видаляє іони Са2 + з цитоплазми в міжклітинний простір, був відкритий в 1966 році. Молекулярні властивості Са2 + насосів плазмалемми описані в декількох оглядах (18), однак достовірних даних про швидкість виведення Са2 + і регуляції
Са2 + насосів в нервових клітинах небагато. Недавно був розроблений двухфлуоресцентний мікрокраплинного

Сторінки: 1 2 3 4 5