Реферати » Реферати по біології » Атф індуковане зміна внутрішньоклітинної концентрації кальцію в нейронах неокортексу щурів

Атф індуковане зміна внутрішньоклітинної концентрації кальцію в нейронах неокортексу щурів

| | | | |
| A1 | | A2a | A2b | | A3 | | P2x | | P2y | | P2t | | P2z | | P2u | | P2d |

Таблиця 1 Класична схема субклассіфікаціі пуринів-рецепторів.

5 Перекласифікація пуринорецепторов.

З - за всезростаючих труднощів і неузгодженостей в класичній схемі класифікації Р2 пуринорецепторов і увеличивающемся числі підтипів рецепторів, стало очевидним, що класична схема вимагає перегляду. В
1994 Abbracchio and Burnstock запропонували нову схему класифікації Р2
- пуринорецепторов. З усіх Р2 - пуринорецепторов вони виокремили три основних сімейства: Р2Х сімейство, пов'язане з іонотропнимі каналами, яке включало чотири підтипи; Р2У - пов'язане з активацією G - білків, що включає сім підтипів і сімейство Р2z - сімейство неселективних пір. Їх гіпотеза грунтувалася в основному на вивченні літературних джерел та аналізі фармакологічного профілю новообнаруженниж агоністів. Надалі теорія підтвердилася клонуванням різних підтипів Р2 - пуринорецепторов. В даний час сімейство Р2Х нараховує шість, а Р2У
- сім підкласів. Завдяки інтенсивним дослідженням, практично не залишається сумнівів в тому, що дані сімейства будуть рости і далі (Collo et al 1996).

| Р2 - пурінорецептори |
| | | |
| | P2Z - неселективні пори | |
| | | |
| Р2Х - сімейство | | Р2У - сімейство |
| іонотропних | | метаботропних |
| рецепторів | | рецепторів |
| | | | | | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | |
| Р2Х1 | Р2Х2 | Р2Х3 | Р2Х4 | Р2Х5 | Р2Х6 | Р2У1 | Р2У2 | Р2У3 | Р2У4 | Р2У5 | Р2У6 | Р2У7 |


Таблиця 2 Сучасна класифікація Р2 типу пуринорецепторов.
ОБ'ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ


1 Підготовка препарату

Дослідження проводились на пірамідальних нейронах моторної області нової кори в тонких зрізах мозку, виділеного з 14 денних щурів. Після декапитации мозок містився в холодний сольовий розчин (0 - 40С). Процедура від початку декапитации до виділення мозку тривала не більше 60-90 секунд.
Потім мозок закріплювався поліакриламідних клеєм на підкладці вібротома
(Campden, Campden Instruments LTD, UK); камера вібротома заливалася холодним сольовим розчином. Зрізи нарезались сагитального товщиною 250 - 300 мкм; швидкість подачі леза - 1 см / с з частотою 10 Гц. Після приготування зрізи поміщалися в розчин постійно насичується карбогеном (5% СО2 + 95%
О2). Перед завантаженням флуоресцентним барвником зрізи инкубировались в постійно оксигенируемом розчині 30 хвилин при температурі 32 градуси.
Забарвлення зрізу здійснювалася протягом 30 - 35 хвилин в СО2 насиченому термостаті при температурі 35 градусів. Після фарбування зрізи відмивалися 1 -
1,5 години на постійно оксигенируемом розчині при кімнатній температурі. Всі експерименти проводилися при температурі 32 градуси.

2 Характеристики кальцієвого зонда

Для кількісного визначення концентрації кальцію в пірамідальних нейронах моторної області нової кори використовувався барвник Фура-2 AM
( рисунок 2) (16).

На малюнку 3 представлений спектр зонда Фура-2 AM. При зв'язуванні з кальцієм відбувається характерне зміна спектра порушення цієї барвника: при порушенні світлом з довжиною хвилі 390 нм відбувається зменшення флуоресценції, а при порушенні світлом, з довжиною хвилі 340 нм - збільшення. Однак, 340 нм є вже ультрафіолетовим світлом, і для її використання необхідний мікроскоп з кварцовими лінзами. Оскільки в нашому випадку був використаний звичайний мікроскоп, то друга хвиля була обрана довжиною 390 нм. 360 нм - це ізобестіческая точка зонда Фура-2, тобто флуоресцентний сигнал при порушенні світлом цієї довжини хвилі не залежить від концентрації Ca2 + і є функція лише концентрації зонда.

Вимірювання флуоресценції при збудженні двома довжинами хвиль дозволяє легко розрахувати [Ca2 +] i в клітці за формулою (24):

[Ca2 +] i = Kd * b * ( R - Rmin) / (Rmax-R) де Кd - константа дисоціації комплексу Фура-2 з кальцієм,
R = F360 / F390 - поточне ставлення флуоресцентних сигналів, Rmin =
F360 / F390 | Ca0 - те ж відношення в розчині з низькою концентрацією Ca2 +,
Rmax = F360 / F390 | CaҐ - те ж відношення в розчині з високою концентрацією
Ca2 +, b = F390 | Ca0 / F390 | CaҐ - відношення флуоресцентних сигналів в низької та високої концентрації Ca2 + при збудженні довжиною хвилі 390 нм. Параметри
Rmin, Rmax і b визначали експериментально. Для цього були приготовлені базовий розчин (в ммоль / л): KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH = 7.2), Фура-2-
0.005; розчин з низькою концентрацією Ca2 + готувався без додавання Ca2 + з добавкою EGTA - 10; розчин з високою концентрацією Ca2 + - з добавкою CaСl2
- 10. Відношення величин флуоресценції визначалося в краплях наведених вище розчинів, поміщених на дно експериментальної камери. В результаті для нашої системи Rmin = 0.33, Rmax = 8.9 і b = 12.8. Параметр Кd був узяв з роботи [Grinkiewicz et al, 1985] і дорівнював 224 нмоль / л.

3 Забарвлення зрізів флуоресцентним барвником

Для введення кальцій - чутливого зонда в клітку, зрізи инкубировались в розчині Тіроде, що містить естеріфіцірованний незаряджену форму барвника Фура-2 ацетоксіметілестер в концентрації 5 мкмоль / л, розчинену в диметилсульфоксиді з додаванням детергенту
Плуронік F-127 (0.02%). У такій формі барвник проникає в клітину, потім ендогенними естеразами ефірні групи отщепляются, зонд стає зарядженим і покинути клітку не може. Забарвлення проводилася 20 хвилин при температурі 35оС. Концентрація зонда в клітці визначалася шляхом титрування забарвлених клітин розчином барвника, який додавався у позаклітинний розчин. Оцінена таким способом концентрація зонда в клітці була в діапазоні 30 - 70 мкмоль / л.

4 Структура експериментальної установки для двох-хвильового виміру концентрації кальцію

Принципова схема установки представлена ??на малюнку 4 Основними елементами її є: джерело світла, система зміни фільтрів, мікроскоп ,
ФЕУ, модуль попередньої обробки сигналу і комп'ютер.

Джерелом збудливого світла служить ртутна лампа потужністю 50 ватів.
Оскільки як кальцій - чутливого зонда використовували індикатор
Фура-2 АМ, який є за збудженню двохвильовим (см. Вище), то для кількісного визначення [Ca2 +] i необхідно було одночасно індукувати флуоресценцию обома довжинами хвиль. У нашій конфігурації періодична зміна фільтрів збудження була реалізована за допомогою обертання колеса з вмонтованими в нього двома інтерференційними фільтрами
360 і 390 нм. Частота обертання була 5 Гц. Управління системою зміни фільтрів здійснювалося за допомогою кальцій - вимірювального модуля фірми
Luigs und Neumann, Німеччина. Цей же модуль був інтерфейсом попередньої обробки.

Оптична частина установки була змонтована на базі мікроскопа
Axioskop, Zeiss. Розділення потоків збудливого світла і флуоресценції вироблялося за допомогою дихроическим дзеркала. Світло, що пройшло через фільтр для порушення флуоресценції, відхилявся дихроическим дзеркалом і за допомогою високоаппертурного иммерсионного об'єктива (40 *, апертура 0.75) фокусувався на об'єкті. Флуоресцентне світло проходив через відповідний інтерференційний фільтр і подавався на фотоелектронний помножувач (ФЕУ). Для зменшення рівня шумів фіксована діафрагма (1 мм) була розташована перед ФЕУ. В результаті флуоресцентний сигнал збирався з фокальній площині діаметром 50 мкм, що дозволило значно поліпшити співвідношення сигнал / шум.

Модуль попередньої обробки дозволяв виробляти компенсацію автофлуоресценціі і, при необхідності, посилювати сигнал, після чого він оцифровується за допомогою цифрового інтерфейсу TIDA і оброблявся комп'ютером за допомогою програм Tida 5.0 і Wintida, розроблених в
Гейдельберзі, Німеччина.

Малюнок 4. Принципова схема експериментальної установки для двухволнового виміру кальцію.

5 Розчини й зміна розчинів

При роботі зі зрізами все розчини готувалися на основі розчину Тіроде
(в ммоль / л): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl2 - 1, CaCl2 - 2.5, NaHCO3 - 26,
KH2PO4 - 1.6, глюкоза - 10, постійно аерувати газовою сумішшю 95% О2
+ 5% СО2 (pH = 7.4). Бескальциевом розчин готувався еквімолярної заміною
CaCl2 на MgCl2 і добавкою 1 ммоль / л EGTA, розчини з підвищеним вмістом калію або кофеїну - заміною NaCl на відповідну кількість KСl або кофеїну.

Зміна розчинів проводилася протокою, швидкість якого можна було варіювати від 10 до 20 мл / хв. Обсяг експериментальної камери становив
0.5 мл. Всі експерименти були проведені при температурі (32 (С).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Аплікація АТФ в більшості нейронів моторної кори (98 з 102) викликає швидке і короткочасне підвищення концентрації цитозольного кальцію [Ca2 +] i. Концентрація [Ca2 +] i досягає свого максимуму протягом 6-8 секунд і потім відновлюється до базального рівня при триваючому присутності АТФ. Відмивання АТФ призводить до відновлення
[Ca2 +] i до рівня спокою. Характерний вид АТФ - індукованого кальцієвого транзиента представлений на малюнку 5

Амплітуда АТФ - індукованого кальцієвого транзиента варіювалася в межах від 50 до 450 нМ. Середнє значення викиду [Ca2 +] i викликаного додатком АТФ в концентрації 100 мкМ знаходилося в межах 200-250 нМ.

Спостерігалась доза - залежність амплітуди відповіді від концентрації АТФ в межах від 10 до 2000 мкМ. На малюнку 7 представлена ??апроксимация експериментальних точок сигма - функцією. Концентрація АТФ, при якій амплітуда відповіді становить половину максимальної, - 220 ± 20 мкМ.

Метою наших досліджень було визначення підтипів пуринорецепторов залучених до генерацію [Ca2 +] i транзиента. Відомо, що АТФ активує кілька типів пуринорецепторов, а саме Р2 пурінорецептори підтипів Р2х і Р2у (Peter Illes et al, 1993, Burnstock and Kennedy 1985), а також Са2 + канали плазмалемми (Кришталь, 1983).

З метою забезпечення достовірності отриманих даних, зважаючи на той факт, що робота проводилась на тонких зрізах

Сторінки: 1 2 3 4 5

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар