Реферати » Реферати по біології » Біологічна роль, структура і виділення мітохондрій з печінки щурів.

Біологічна роль, структура і виділення мітохондрій з печінки щурів.

Шляхом очищені фракції мітохондрій були виділені із самих різних клітин тваринного і рослинного походження і навіть з деяких найпростіших.

У більш ранніх дослідженнях мітохондрій, як правило, отримували з печінки тварин, так як її клітини дуже легко зруйнувати, а так само тому, що вона багата мітохондріальної фракцією. Після того, як було виявлено, що бактеріальна протеиназа руйнує клітину, не пошкоджуючи мітохондрій, був розроблений простий і швидкий метод отримання м'язових мітохондрій.
Сахароза сприяєзбереження мітохондрій, стабілізуючи мітохондріальну мембрану.

Гомогенизация матеріалу. Методи гомогенізації:

- Руйнування клітин
(гомогенізатор Даунса 5-12 мл + щільно прилеглий товкач). Гіпотонічний шок + гомогенізатор.

- Метод заснований на кавітації газів
(клітинна суспензія збагачена газоподібним азотом на 15-30 хвилин витримується при тиску до 65 атм., При швидкому зниженні тиску до атмосферного, внаслідок виділення азоту відбувається руйнування клітин.
Органели залишаються інтактними).

- Ультразвук.
Склад середовища в якій руйнують клітини визначається застосовуваним методом гомогенізації. Для руйнування тканин використовують ізоосмотіческій розчин сахарози з розрахунку 100 мл на 10 г сирого ваги тканини, при цьому нестрашно якщо розчину сахарози буде трохи більше, особливо при центрифугировании в роторі з більшим обсягом. Гіпотонічна середа сприяє руйнуванню клітин, але, якщо обробка триває занадто довго, при цьому може відбуватися руйнування клітинних органел. Інші параметри середовища важко узагальнити і кожен мембранний препарат вимагає індивідуального підходу.

Поділ субклітинних компонентів.

- Центрифугування.
Заснований на відмінностях за швидкістю седиментації (визначається вагою, розміром і формою частинок). Речовина, що використовується для приготування градієнта повинно бути легко розчинно у воді, фізіологічно нешкідливо і хімічно інертно; його розчин повинен бути нев'язки, прозорим у видимій і УФ-областях спектра, повинен створювати низьке осмотичний тиск. Зазвичай поділ субклітинних компонентів проводять в градієнті щільності сахарози. Він задовольняє більшості зазначених вимог, але при високих концентраціях він вельми в'язок. Як правило поділ здійснюється за 3-4 години або протягом ночі при 80.000 д або вище в роторі з підвісними стаканчиками.

Обробка гомогената з печінки пацюки 10 мМ фосфатом калію збільшує швидкість седиментації мітохондрій, не впливаючи на осадження лізосом, що дозволяє очищати останні в градієнті щільності Перколла.

- Поділ в двофазної системі, яка містить два полімеру.

Корисним і швидким способом виділення мембран є поділ їх у водному двухфазной системі декстран - поліетиленгліколь (ПЕГ), особливо якщо відсутні необхідні ультрацентрифуги і ротори. Метод, продуктивність якого може бути легко підвищена, заснований на використанні цілого ряду властивостей мембран, включаючи електричний заряд, щільність, масу і гидрофобность. Різниця в цих властивостях обумовлює різний розподіл компонентів суміші між верхньою і нижньою фазами і поверхнею розділу. За спорідненості до верхньої фазі компоненти тваринної клітини розташовуються в наступному порядку: ендоплазматичнийретикулум / мітохондрій / лізосоми / апарат Гольджі / плазматичні мембрани Успіх у застосуванні фазових систем залежить від адекватності вибору їх складу. Якість поділу залежить не тільки від конкретного полімеру (поки кількість їх обмежена - в основному використовують декстран і ПЕГ), але і від інших параметрів: молекулярної маси полімеру, концентрації солей, рН, хімічної модифікації полімеру.

- Електрофорез.

За допомогою високовольтного електрофорезу у вільному потоці можна отримати препарати субклітинних мембран і органел високого ступеня чистоти.
Підлягали розділенню суміш компонентів подають тонкою цівкою в розмежує буфер, який рухається в електричному полі; мембрани, несучі різний електричний заряд переміщуються в розділяє комірці зі швидкістю, яка визначається їх зарядом, при цьому досягається 100%-ное дозвіл. Це м'який спосіб виділення мембран з високим препаративних виходом. Методику електрофорезу у вільному потоці вперше застосували для виділення лізосом і мітохондрій з печінки пацюки.

Таблиця 1 Ферменти - маркери мітохондрій
| Фракція | | Маркерний фермент |
| Мітохондрії | Внутрішня | Сукцінатдегідрагеназа, Цітохромкідаза, |
| | мембрана | Ротен-нечувствительная NADH - цитохром с |
| | | - редуктаза |
| Мітохондрії | Зовнішня | моноамінооксидази, кінуренін-3-гидроксилаза |
| | мембрана | |

У таблиці 1 наведені ферментні маркери, до яких відносяться порівняно стабільні ферменти, активність яких досить висока і її зручно вимірювати. Зазвичай ці вимірювання проводять якнайшвидше після виділення; зразок при цьому зберігають при 40С і не заморожують. Відзначено, що такий фермент, як цитохром с - редуктаза може виявитися лабільним і втрачати активність в заморожених препаратах мембран з печінки. Для правильної оцінки розподілу ферменту-маркера досить істотним є просторове розташування субстрат-зв'язуючого сайту.

Методики

Субфракціонірованіе мембран і компонентів матриксу мітохондрій.

Мітохондрії виділяють з численних джерел стандартними методами. Субфракціонірованіе їх для отримання внутрішніх і зовнішніх мембран і компонентів матриксу проводять після заморожування - відтавання препарату та / або обробки ультразвуком стандартного осаду мітохондрій, суспендованих в середовищі, що містить 1.2 М сахарози і 2 мМ АТР (10 мг мембранного білка на 1 мл). При цьому відбувається руйнування мітохондрій, а після центрифугування в ступінчастому градієнті щільність сахарози зовнішні мембрани концентруються в смузі 0,45-1,12 М сахарози, внутрішні мембрани і компоненти матриксу збираються в осаді, під нижнім шаром з концентрацією сахарози 1,2 М, а проміжна везикулярна фракція - між двома попередніми, в смузі 1,12-1,20М.

Маркерами внутрішніх мітохондріальних мембран служать ферменти - переносники електронів. Зовнішня мітохондріальна мембрана, яка при фрагментації утворює везикули, подібні по щільності і морфології з везикулами з плазматичної мембрани містить моноамінооксидазу. Описано також метод виділення зовнішніх мітохондріальних мембран з печінки щурів.

Метод противоточного розподілу мітохондрій.

Препарати мітохондрій, виділені з печінки пацюки, були досліджені
Ерікссоном за допомогою методу противоточного розподілу. Мітохондрій, що входять до складу кожного з цих препаратів, можна розділити на дві основні популяції. Однак елетронній-мікроскопічне дослідження не дозволило виявити ніяких відмінностей в структурі цих частинок.

Робоча методика виділення мітохондрій з печінки щурів.

- середу виділення: 0,25 М розчин сахарози, який містить 0,001 М ЕДТА, рН 7,4

- Сахароза - 0,25 М розчин

- НС1 - 1 н і 0,1 н розчини

- КОН - 1 н і 0,1 н розчини

Все реактиви готуються на бидистиллированной воді.

Ізольовану печінку щури занурюють в 30 мл крижаної середовища виділення.
Після 2х - Зх кратного промивання тканина подрібнюють ножицями на чашці
Петрі, що стоїть на льоду. Кашку знову розміщують в стаканчик зі свіжою середовищем виділення і ретельно промивають. Після осідання шматочків тканини на дно, рідину обережно зливають і промивання повторюють ще двічі. Тканина переносять в гомогенізатор, додають 40 мл середовища виділення і подрібнюють протягом 30 - 40 секунд. До гомогенату додають 40 мл середовища виділення, перемішують повільно обертається товкачиком і розливають його в 2 центрифужних склянки. Центрифугують протягом 10 хвилин при 0-2 ОС, при 600 д для видалення уламків клітин та ядерної фракції.

Супернатант обережно зливають і зберігають на льоду, залишки об'єднують і знову гомогенизируют 20 секунд в 20 мл середовища виділення. Гомогенат центрифугують при 600 д 10 хвилин, супернатант об'єднують з отриманим раніше.

Для осадження мітохондрії, об'єднаний супернатант центрифугируют в двох склянках при 14000 g протягом 10 хвилин. Залишки об'єднують в одній склянці і ретельно суспендується за допомогою піпетки на 1 мл в невеликому обсязі середовища виділення (близько 0,5 мл). .Маленькімі Порціями, при обережному струшуванні додають 10 мл середовища виділення і осаджують мітохондрії (14000 g, 10 хвилин). Осад суспендують у 0,25 М сахарозі, яка не містить ЕДТА, і знову центрифугують (14000 g, 10 хвилин). Супернатант зливають, на отриманий осад мітохондрії обережно нашаровуються 0,2 - 0,3 мл 0,25 М сахарози. Легким струшуванням змивають верхній пухкий шар осаду.
Процедуру повторюють ще двічі і отриманий щільний осад мітохондрії ретельно суспендується за допомогою піпетки в 0,4 - 0,5 мл 0,25 М сахарози.
Густішу суспензію мітохондрії переносять у пробірку і зберігають на льоду.

Висновок

У даній роботі запропоновані різні методики виділення мітохондрії з печінки щурів, але використовуватися буде метод із застосуванням ультрацентрифугирования, як найбільш прийнятний і задовольняє критеріям простоти роботи і необхідного ступеня чистоти продукту.

Надалі планується фотометрическое вивчення впливу етідіумброміду на активність цитохрома з з мітохондрії печінки щурів. Дана робота становить практичний інтерес, так як цитохром с є індуктором апоптозу - програмованої загибелі клітин. Механізми цього процесу в даний час становлять великий інтерес (для лікування онкологічних захворювань).

Список літератури
1. Альбертсон Пер-Оке "Поділ клітинних частинок і макромолекул", Москва,

1974
2. Боуен Т. "Введення в ультрацентрифугирование", Москва, 1973
3. Под ред. Гілярова М.С. "Біологія. Великий енциклопедичний словник",

Москва, 1998
4. Ленинджер А. "Мітохонрія" Москва "Мир", 1966
5. Решетніков В.Н. та ін. "Техніка біохімічного дослідження субклітинних структур і біополімерів" т.2, Мінськ, 1977
6. Еванз У. Г. "Біологічні мембрани. Методи", Москва, 1990


Сторінки: 1 2

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар