Реферати » Реферати по біології » Методи дослідження в цитології

Методи дослідження в цитології

Мурманський державний технічний університет

Кафедра біології

Доповідь на тему:

"Методи дослідження в цитології"

Виконав:

Студентка 1-го курсу

Технічного факультету

Кафедри Біологія

Серебрякова Лада В'ячеславівна

Перевірив:

Мурманськ 2001

План:
1. Що вивчає цитологія.
2. Уявлення про те, що організми складаються з клітин.
3. Методи дослідження, застосовувані в цитології.
4. Фракционирование клітин.
5. Радіоавтографія.
6. Визначення тривалості деяких стадій клітинного циклу методом радиоавтографии.

Цитологія - наука про клітину. З середовища інших біологічних наук вона виділилася майже 100 років тому. Вперше узагальнені відомості про будову клітин були зібрані в книгу Ж.-Б. Карнуа «Біологія клітини» , що вийшла в
1884 році. Сучасна цитологія вивчає будову клітин, їх функціонування як елементарних живих систем: досліджуються функції окремих клітинних компонентів, процеси відтворення клітин, їх репарації, пристосування до умов середовища і багато інших процесів, що дозволяють судити про загальні для всіх клітин властивості і функції. Цитологія розглядає також особливості будови спеціалізованих клітин. Іншими словами, сучасна цитологія - це фізіологія клітини. Цитологія тісно поєднана з науковими та методичними досягненнями біохімії, біофізики, молекулярної біології і генетики. Це послужило підставою для поглибленого вивчення клітини вже з позицій цих наук і появи певної синтетичної науки про клітині - біології клітини, або клітинної біології. В даний час терміни цитологія і біологія клітини збігаються, так як їх предметом вивчення є клітина з її власними закономірностями організації та функціонування. Дисципліна «Біологія клітини» відноситься до фундаментальних розділах біології, бо вона досліджує і описує єдину одиницю всього живого на Землі - клітину.

Тривале і пильне вивчення клітини як такої призвело до формулювання важливого теоретичного узагальнення, що має общебиологическое значення, а саме до появи клітинної теорії. В XVII в. Роберт Гук, фізик і біолог, який відрізнявся великою винахідливістю, створив мікроскоп.
Розглядаючи під своїм мікроскопом тонкий зріз пробки, Гук виявив, що вона побудована з малесеньких нічим не заповнених осередків, розділених тонкими стінками, які, як це нам тепер відомо, складаються з целюлози. Він назвав ці маленькі осередки клітинами. Надалі, коли інші біологи почали досліджувати під мікроскопом рослинні тканини, виявилося, що маленькі осередки, виявлені Гуком в мертвої висохлою пробці, є і в живих рослинних тканинах, але у них вони не порожні, а містять кожна по маленькому студенистому тільцю. Після того, як мікроскопічному дослідженню піддали тварини тканини, було встановлено, що вони також складаються з дрібних драглистих тілець, але що ці тільця лише в рідкісних випадках відокремлені один від одного стінками. В результаті всіх цих досліджень в 1939 р Шлейден і Шванн незалежно один від одного сформулювали клітинну теорію, що говорить, що клітини є елементарні одиниці, з яких в кінцевому рахунку побудовані всі рослини і всі тварини. Протягом якогось часу двоякий сенс слова клітина ще викликав деякі непорозуміння, але потім він міцно закріпився за цими маленькими желеподібними тільцями.

Сучасне уявлення про клітині тісно пов'язано з технічними досягненнями та вдосконаленнями методів дослідження. Крім звичайної світлової мікроскопії, не яка втратила своєї ролі, в останні кілька десятиліть велике значення придбали поляризационная, ультрафіолетова, флюоресцентная, фазовоконтрастная мікроскопія. Серед них особливе місце займає електронна мікроскопія, роздільна здатність якої дозволила проникнути і вивчити субмікроскопічну і молекулярну структуру клітини.
Сучасні методи дослідження дозволили розкрити детальну картину клітинної організації.

Кожна клітина складається з ядра і цитоплазми, відділених один від одного і від зовнішнього середовища оболонками. Компонентами цитоплазми є: оболонка, гиалоплазма, ендоплазматична мережа і рибосоми, апарат Гольджі, лізосоми, мітохондрії, включення, клітинний центр, спеціалізовані органели.

Частина організму, що виконує якусь особливу функцію, називають органом. Будь-який орган - легке, печінка, нирка, наприклад - має кожен свою особливу структуру, завдяки якій він грає певну роль в організмі. Точно так же в цитоплазмі є особливі структури, своєрідне будова яких дає їм можливість нести певні функції, необхідні для метаболізму клітини; ці структури називають органелами
(«маленькими органами» ).

З'ясування природи, функції і розподілу органел цитоплазми стало можливим лише після розвитку методів сучасної біології клітини. Найбільш корисними в цьому відношенні виявилися: 1) електронна мікроскопія; 2) фракціонування клітин, за допомогою якого біохіміки можуть виділяти відносно чисті фракції клітин, що містять певні органели, і вивчати, таким чином, окремі цікаві для них метаболічні реакції;
3) радіоавтографія, що зробила можливим безпосереднє вивчення окремих метаболічних реакцій, що протікають в органелах.

Метод, за допомогою якого органели виділяють з клітин, називають фракционированием. Цей метод виявився дуже плідним, давши біохімікам можливість виділяти різні органели клітини у відносно чистому вигляді.
Він дозволяє, крім того, визначати хімічний склад органел і що містяться в них ферменти і на підставі одержуваних даних робити висновки про їх функції в клітині. В якості першого кроку клітини руйнують шляхом гомогенізації в який-небудь підходящої середовищі, яка забезпечує збереження органел і запобігає їх агрегацію. Дуже часто для цього використовують розчин сахарози. Хоча мітохондрії і багато інших клітинні органели залишаються при цьому неушкодженими, такі мембранні переплетення, як ендоплазматичнийретикулум, а також плазматична мембрана, розпадаються на фрагменти. Однак утворюються фрагменти мембран нерідко замикаються самі на себе, в результаті чого виходять округлі бульбашки різних розмірів.

На наступному етапі клітинний гомогенат піддають ряду центрифугування, швидкість і тривалість яких щоразу зростає; цей процес називається диференціальним центрифугуванням.
Різні органели клітини осідають на дні центрифужних пробірок при різних швидкостях центрифугування, що залежить від розмірів, щільності та форми органел. Утворений осад можна відібрати і досліджувати. Швидше за всіх осідають такі великі і щільні структури, як ядра, а для осадження дрібніших і менш щільних структур, таких, як бульбашки ЕПР, потрібні більш високі швидкості і більш тривалий час. Тому при низьких швидкостях центрифугування ядра осідають, а інші клітинні органели залишаються в суспензії. При більш високих швидкостях осаджуються мітохондрії і лізосоми, а при тривалому центрифугировании і дуже високих швидкостях в осад випадають навіть такі дрібні частинки, як рибосоми. Опади можна досліджувати за допомогою електронного мікроскопа, щоб визначити чистоту отриманих фракцій. Всі фракції до деякої міри забруднені іншими органелами. Якщо проте вдається домогтися достатньої чистоти фракцій, то їх піддають потім біохімічному аналізу, щоб визначити хімічний склад і ферментативну активність виділених органел.

Порівняно недавно був створений інший метод фракціонування клітин
- центрифугування в градієнті щільності; при цьому центрифугування роблять у пробірці, в якій попередньо напластовують один на одного розчини сахарози все зростаючої концентрації, а отже, і зростаючій щільності. При центрифугировании містяться в гомогенате органели розташовуються в центрифужной пробірці на тих рівнях, на яких знаходяться розчини сахарози, відповідні їм по щільності. Цей метод дає біохімікам можливість розділяти органели однакових розмірів, але різної щільності (рис. 1.).

Радіоавтографія - порівняно новий метод, безмірно що розширив можливості як світловий, так і електронної мікроскопії. Це найвищою мірою сучасний метод, зобов'язаний своїм виникненням розвитку ядерної фізики, яке зробило можливим отримання радіоактивних ізотопів різних елементів. Для радиоавтографии необхідні, зокрема, ізотопи тих елементів, які використовуються клітиною або можуть зв'язуватися з речовинами, використовуваними клітиною, і які можна вводити тваринам або додавати до культур в кількостях, що не порушують нормального клітинного метаболізму. Оскільки радіоактивний ізотоп (або позначене їм речовина) бере участь в біохімічних реакціях так само, як його нерадіоактивні аналог, і в той же час випускає випромінювання, шлях ізотопів в організмі можна простежити за допомогою різних методів виявлення радіоактивності. Один із способів виявлення радіоактивності заснований на її здатності діяти на фотоплівку подібно до світла; але радіоактивне випромінювання проникає крізь чорну папір, використовувану для того, щоб захистити фотоплівку від світла, і надає на плівку таку ж дію, як світло.

Щоб на препаратах, призначених для вивчення за допомогою світлового або електронного мікроскопів, можна було виявити випромінювання, що випускається радіоактивними ізотопами, препарати покривають в темному приміщенні особливої ??фотоемульсією, після чого залишають на деякий час в темряві. Потім препарати виявляють (теж в темряві) і фіксують. Ділянки препарату, містять радіоактивні ізотопи, впливають на лежачу над ними емульсію, в якій під дією випускається випромінювання виникають темні
«зерна» . Таким чином, отримують радіоавтографія (від грец. Радіо - лучевідний, аутос - сам і графо - писати).

Спочатку гістологи мали лише кількома радіоактивними ізотопами; так, наприклад, у багатьох ранніх дослідженнях із застосуванням радиоавтографии використовувався радіоактивний фосфор. Пізніше стали використовувати значно більше таких ізотопів; особливо широке застосування знайшов радіоактивний ізотоп водню - тритій.

Радіоавтографія мала і має досі дуже широке застосування для вивчення того, де і як в організмі протікають ті чи інші біохімічні реакції.

Хімічні сполуки, мічені радіоактивними ізотопами, які використовуються для дослідження біологічних процесів, називають попередниками. Попередники - це звичайно речовини, подібні до тих, які організм отримує з їжі; вони служать будівельними блоками для побудови тканин і включаються в складні компоненти клітин і тканин таким же чином, як в них включаються немічених будівельні блоки. Компонент тканини, в який включається мічений попередник і який випускає випромінювання, називається продуктом.

Клітини, вирощувані в

Сторінки: 1 2