Реферати » Реферати по біології » Отримання моноклональних антитіл

Отримання моноклональних антитіл

Міністерство освіти Російської Федерації

Самарський Державний Університет

Реферат на тему:

ОТРИМАННЯ моноклональних антитіл

Виконала студентка 542 Б групи біологічного факультету СамГУ

Миронова Ірина

Самара

2001
Введення

Для багатьох досліджень, пов'язаних з вивченням біологічних структур велику цінність представляють реагенти, здатних специфічно взаємодіяти з даною структурою. Універсальним реагентом, що володіє зазначеним властивістю, вважається молекула імуноглобуліну. Незважаючи на те, що імуноглобуліни, будучи антитілами, взаємодіють тільки з антигеном, тобто з молекулою здатної викликати імунну відповідь, для більшості структур вдається підібрати умови, за яких вони стають антигенами і індукують вироблення компліментарних антитіл (наприклад, при кон'югації з сильними імуногенний) . Саме цим пояснюється велике поширення імунологічних методів, пов'язаних з використанням антитіл, в різних областях біології та медицини.

Серйозну проблему при застосуванні антисироваток для ідентифікації та кількісного визначення антигенів в різних областях досліджень представляє неспецифічне зв'язування та перехресна реактивність антитіл.

Історія створення методу

Багато дослідників намагалися відшукати способи отримання антитіл з вузькою специфічністю. Так, за певних умов імунізації бактеріальними полісахаридами вдається отримати високогомогенний апарат антитіл з вузькою специфічністю. Крім того, можливо злиття плазмацітоми
(пухлини, що виникла через антітелообразующіх клітини або її попередника) з клітинами селезінки імунізованих тварини, отримавши таким чином гібридні клітини (гібридоми), що успадкували від пухлинних клітин здатність необмежено розмножуватися, а від клітин селезінки - синтезувати антитіла зумовленої специфічності.

Передумовами для виникнення методу отримання гібридом, синтезують моноклональні антитіла, були розробки двох методологічних підходів:

1) отримання мієлом, адаптація їх до умов культивування поза організмом;

2) метод соматичної гібридизації клітин.

У мишей досить легко отримати мієломи (плазмацітоми). Ці пухлини є нащадками однієї клітини (тобто мають моноклональное походження) і секретують унікальні імуноглобуліни, деякі з яких можуть взаємодіяти з відомими антигенами. Пухлини індукують у тварин шляхом внутрішньочеревно введення мінеральних масел або інертного твердого пластика. Для виникнення мієлом велике значення має генетичний статус тварини, і лише у двох ліній інбредних мишей експериментаторам вдалося отримати такі пухлини.
Мієломні клітини миші виявилися надзвичайно зручними для вивчення біохімії продукції імуноглобулінів і дали дуже багато чого для розуміння структури, механізмів секреції та їх функції. Однак, мієломна система як джерело антитіл до більшості антигенів не виправдала надії дослідників - не вдавалося імунізувати тварин, а потім отримати мишачі мієломи, продукують антитіла до иммунизируется антигену. З тисяч мієломних пухлин, індукованих у мишей, лише поодинокі виробляли імуноглобуліни, які реагували з відомими антигенами, що було виявлено шляхом грубого скрінірованія з безліччю потенційних антигенів. Таким чином, мієломні білки виявлялися з невідомої антигенної специфічністю.
Іншою передумовою виникнення методу отримання гібридом з'явилася техніка гібридизації соматичних клітин, розробка яких широко проводилась після відкриття феномена спонтанної гібридизації. При злитті плазматичних мембран клітин утворюються клітини з двома або більшою кількістю ядер - гетерокаріони. Після першого поділу ядра зливаються і утворюється одне ядро ??з набором хромосом від всіх злилися партнерів - утворюється гібридна клітина. Низьку частоту утворення гібридів можна було збільшити, використавши ряд агентів, що викликають злиття: вірус Сендай, лизолецитин, поліетиленгліколь.
Навіть при використанні агентів, що підвищують злиття, частота утворюються гібридів вкрай низька. Для їх виділення необхідні селективні середовища, що дозволяють рости переважно утворився гібридам. В даний час розроблено декілька принципів селекції гібридних клітин. Одним з найбільш поширених є метод, заснований на застосуванні системи, що містить гіпоксантин, амідоптерін і тимідин (система ГАТ).
Селекція гібридних клітин заснована на тому, що в ГАТ середовищі батьківські мієломні клітини гинуть, а нормальні клітини селезінки не володіють здатністю рости за даних умов культивування, так що виживають і розмножуються тільки гібридні клітини, що успадкували від батьківських клітин здатність розмножуватися і синтезувати специфічні імуноглобуліни.

Підготовчі етапи перед проведенням злиття

Повністю процедура отримання моноклональних антитіл включає в себе наступні етапи: імунізація тварин; підготовка клітин до злиття; злиття; відбір індукують специфічні антитіла клонів; клонування і реклонірованіе; масова напрацювання гібридомних клітин; отримання культуральної рідини або асциту, що містять антитіла; виділення антитіл.
Зазвичай вся процедура від моменту початку імунізації до виділення антитіл займає 3-4 місяці.
Організація роботи та обладнання. Для роботи з отримання гібридом бажано виділити окреме приміщення. Експеримент можна проводити і в частині великої кімнати, максимально віддаленої від вхідних дверей. Це приміщення треба оснастити наступним обладнанням:
Ламінарний бокс з вертикальною або горизонтальною подачею стерильного повітря. Стерильність забезпечується наявністю фільтрів, що затримують частки крупніше 0,3 мкм.
Інкубатор, в якому автоматично підтримується вологість, температура і концентрація СО2.
Повільна центрифуга з підвісними склянками, бажано з охолодженням.
Звичайний і інвертований мікроскопи з фазово-констрастності пристроєм.
Холодильник на +4 і на-200 С.
Водяна баня на +37 і +560 С.
Крім цього в окремому приміщенні бажано мати морозильник на-700 С і посудину Дьюара з рідким азотом для зберігання клітин. Для отримання гібридом потрібно придбати також спеціальну пластикову посуд для культури клітин:
96-ямкові планшети з плоским дном, 24-ямкові планшети, флакони з площею росту 25, 75 см2 і ін., Пластиковий посуд для проведення імуноферментного і радиоиммунологического аналізів, середовища для культивування, необхідні реактиви, сироватку плоду корови (СПК).
Приготування окремих компонентів середовищ для культивування. Основними середовищами, вживаними для отримання гібридом, є середа RPMI 1640 та середу Голка в модифікації Дульбекко. Застосовуються й інші середовища, зокрема, середа Дульбекко в модифікації іксів. Середовища випускаються у вигляді готових розчинів, 10-кратних концентратів і сухих порошків. Кращі результати виходять при приготуванні середовищ в умовах лабораторії із сухих порошків, однак при цьому важливе значення має якість води. Для приготування середовищ необхідна деионизированная і двічі перегнанная в кварцовою посуді вода.
Вибір експериментального тварини. Зазвичай для імунізації використовують мишей і щурів. Це пов'язано з тим, що підходящі мієломні клітини мишей і щурів широко поширені і, крім цього, не представляє складнощів вирощування отриманих гібридом в організмі цих тварин.
Інші тварин практично не використовуються.
При імунізації тварин імунну відповідь виробляється на всі антигенні детермінанти всіх компонентів що вводиться матеріалу. Це значно ускладнює відбір клонів, які продукують антитіла до цікавить антигенної детермінанті, так як їх частка може бути вкрай незначною. Тому по можливості для імунізації застосовують очищені антигени, принаймні на останніх етапах імунізації. Одним з основних достоїнств гібридомної техніки і є якраз та обставина, що специфічні антитіла проти даного антигену можна отримати, взявши для імунізації неочищений препарат антигену, і вживши згодом ці антитіла для очистки антигену.
Способи імунізації. Призначення процесу імунізації полягає в тому, щоб збільшити частку клітин, що продукують антитіла заданої специфічності, і перевести ці клітини в функціональний стан, при якому вони здатні зливатися і утворювати антітелообразующіе гібридні клітини.
Експериментально встановлено, що для гібридизації необхідні виділяти селезінкові клітини тварин через 3-4 доби після останнього введення антигену, тобто тоді, коли в лімфоїдних органах багато активно проліферуючих клітин.
Конкретна схема імунізації сильно залежить від природи антигену і його імуногенності. Антигени клітинної поверхні є сильними імуногенний, тоді як більшість розчинних білків - слабкі імуногени.
В останньому випадку необхідно застосовувати різні ад'юванти, які посилюють імунну відповідь. Серед ад'ювантов найбільшого поширення отримав повний ад'ювант Фрейнда (ПАФ). Крім цього, використовують введення антигену, преципітувати на квасцах, і введення разом з антигеном убитих клітин
Bordetella Pertussis. Зазвичай антиген вводять неодноразово, що необхідно для розвитку сильної імунної відповіді, хоча надмірна імунізація може мати зворотний ефект - зазначено, що іноді у клітин гіперімунізованих тварин знижується здатність утворювати гібридоми. В деяких випадках буває достатньо і однієї імунізації.
По ходу імунізації необхідно визначати титр антитіл до антигену (титр антитіл - величина, зворотна розведенню сироватки, при якій ступінь імунологічної реакції знижується в два рази порівняно з максимальною).
Зазвичай це роблять перед останньою імунізацією. В досвід набирають тварин з високим титром антитіл. Не слід очікувати хороших результатів гібридизації, якщо при імунізації тварин немає утворення антитіл або вони утворюються в низькому титрі.
Для більшості розчинних антигенів можна використовувати наступну схему імунізації.
Вводять 1-100 мкг антигену в ПАФ або у вигляді преципітату на квасцах внутрибрюшинно. Якщо є можливість, то одночасно вводять 2 * 109 убитих клітин B. Pertussis.
Через 2-3 тижні вводять антиген на фізіологічному розчині внутрибрюшинно або внутрішньовенно. Цю процедуру можна повторювати до появи високого титру антитіл.
Останню імунізацію роблять внутрішньовенно, через 3 доби тварини забиваються, і готується суспензія клітин для гібридизації.
При застосуванні як иммуногена різних клітин (пухлинні клітини, чужорідні клітини крові, бактерії, паразити і т.д.) роблять кілька ін'єкцій без ад'юванта внутрибрюшинно з інтервалом в 2-3 тижні по (1-
5) * 107 клітин. Останню ін'єкцію роблять внутрішньовенно і через 3 дня виділяють клітини селезінки для гібридизації.
Останнім часом активно розвиваються методи повної імунізації поза організмом з метою отримання гібридоми. Імунізація in vitro має ряд істотних переваг: коротшає період імунізації до 4-5 діб; потрібно істотно менша кількість антигену; до багатьох антигенів можна отримати більш виражений імунну відповідь
(частково за рахунок зниження вкладу толерантності та супресії); підвищується відсоток відповідають клітин; легко перевіряти фактори, що впливають на ефективність імунізації.
Сучасні методи імунізації in vitro засновані на двох системах культивування лімфоцитів, розроблених в кінці 1960-х років. Метод суспензійного культивування був першим методом, в якому імунізація повністю проходила поза організмом. Критичними

Сторінки: 1 2

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар