Реферати » Реферати з біології » Як гени людини наносять на карту.

Як гени людини наносять на карту.

Хромосом. Шуканий ген розмножують в пробірці і при цьому мітять його копії, підміняючи, наприклад, водень тритієм. За таким радіоактивним зондом дуже зручно стежити: якщо підмішати його до препарату хромосом і витримати деякий час, він хімічно зв'яжеться з певним бендом певної хромосоми, встав "на своє місце" (це називається "гібридизація in situ", тобто "на місці "). Так були картіровани гени альбуміну, колагену, гормону росту і деякі інші.

Середній розмір бенду - близько 10 Мб: така і точність хромосомної карти. Правда, пізніший вдосконалення - гібридизація з флуоресцентною міткою (FISH - fluorescent in situ hybridization) - підвищило дозвіл до 5-2 Мб. Більше того, розроблений навіть метод гібридизації мічених генів з хромосомами, витягнутими з ядра неделящейся клітини - і значить, де конденсованими, "розхитаною", а не упакованими в компактні освіти. У результаті вдалося локалізувати ділянки до 0,1 Мб.

Карти кДНК відображають розташування експресуються нуклеотиднихпослідовностей. По-російськи це означає наступне. Припустимо, в клітці активно працює, виробляючи білок, ген. Що за ген - невідомо. Де він - теж. Тоді користуються тією обставиною, що при синтезі білка в клітинному ядрі спочатку "штампуються" молекули мРНК - точні копії працюючого гена ("м" - матричні). Сей проміжний продукт можна виловити з клітки і розмножити в пробірці, позначивши тритієм або радіоактивним фосфором. А далі все як при хромосомному картуванні: зонд прилаштувався до ділянки N - значить, експресія йшла тут і, отже, тут розташований ген, що кодує даний білок.


Великомасштабні карти геному

Їх складають за загальним принципом: спочатку шматують ДНК на шматки, розганяють отримані фрагменти в електричному полі (електрофорез) і потім гібрідізіруют з міченим зондом. В результаті фрагменти упорядковуються - відтворюється їх вихідна послідовність. Для цього використовують різні методи пошуку перекриваються ділянок.

У будь-якому випадку необхідно насамперед отримати фрагменти ДНК картіруемого ділянки у великих кількостях. ДНК розмножують зазвичай двома способами - клонуванням і ПЛР.

КЛОНУВАННЯ - за сучасними поняттями порівняно примітивний метод.
Послідовність дій така: порізали рестриктазою досліджуваний ділянку
ДНК - вставили кожен її відрізок в молекулу вектора (бактеріальної, дріжджовий або іншої кільцевої ДНК), розрізану в одній точці тієї ж рестриктазою: вийшла рекомбінантний кільцева ДНК з "чужий" вставкою.
Таку змішану ДНК "вселяють" в ядро ??клітини-господаря (зазвичай бактерії), і та приймається ділитися в культурі, завдяки рекомбінантний ДНК - в.о. її генома - розмножується практично до будь-якої кількості копій. Результат - набір клонів різних фрагментів картіруемой ДНК, або, як його зазвичай називають, бібліотека клонів.

Полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) - лабораторний синтез фрагментів ДНК без клітини-хазяїна. У пробірку до фрагмента, який треба розмножити,
"підсаджують": а) фермент ДНК-полімеразу, який здійснює відтворення ДНК в живих клітинах; б) будматеріал, тобто окремі нуклеотиди; в) прамери - короткі ланцюжки нуклеотидів, відповідні кінців розмножуємо фрагмента. Тут, як бачите, слабке місце методу: про згаданий ділянку треба дещо знати заздалегідь - а саме структуру праймерів ...

Потім пробірку нагрівають - фрагмент від спеки "розклеюється", розділяючись на два ланцюги; пробірку охолоджують - праймери приєднуються до кінців фрагмента і полімераза починає свою справу. Чергуючи нагрівання та охолодження, можна за півтори години довести кількість копій потрібного ділянки
ДНК до декількох мільйонів - в чому і полягає головна перевага ПЛР перед клонуванням. Але у неї є два недоліки. Один вже згаданий - потрібно знати праймери "в обличчя", інакше реакцію не вдасться запустити. Другий - технічна неможливість копіювати фрагменти довше 5-6 п.н.

Після того як всі фрагменти ДНК отримані в достатній кількості копій, їх впорядковують, для чого спершу поділяють електрофорезом, а потім хімічно пов'язують (гибрідизуючою) з міченим зондом, щоб кожен фрагмент встав на своє місце і, так сказати, просигналив про себе: ось він я!

Великомасштабні фізичні карти геному бувають двох типів. Перший -
МАКРОРЕСТРІКЦІОННИЕ (за принципом "зверху вниз"): ДНК ріжуть редкощепящей рестриктазою на великі шматки, впорядковують їх, потім ділять на дрібніші, які теж впорядковують. Така карта охоплює досить великі ділянки геному - до 10 Мб - і не містить пробілів. Але її дозвіл порівняно невелика - від 1 Мб до 100 кб.

Набагато вище точність у КАРТ КОНТІГ. Їх будують за зворотним принципом -
"знизу вгору". Хромосому шаткують на дуже короткі фрагменти, розмножують їх і впорядковують. Набір впорядкованих коротких фрагментів, що покривають певну ділянку хромосоми, - це і є контіга. А де сама вона розташована на хромосомі, можна встановити методом FISH.

Правда, карту контіг важко розширити до великих районів хромосоми, оскільки не можна розмножувати великі фрагменти ДНК - ні клонуванням, ні
ПЛР. Хоча в останні роки досягнуто серйозний успіх: вдалося створити гігантську молекулу-вектор, в яку можна вбудувати ділянку людської
ДНК розміром до мегабази. Цей вектор називається YAC - the yeast artificial chromosome, штучна дріжджова хромосома. До впровадження YAC як векторів застосовувалися в основному бактеріальні плазміди - крихітні колечка
ДНК, що несли вставки чужорідного матеріалу максимум в 20-40 кб. Сенс застосування YAC - значне зменшення числа клонів, які потрібно впорядковувати.


Прогулянка по хромосомі

Всі описані вище методи дозволяють створювати або приблизні карти обширних регіонів геному, або докладні "топографічні плани" дрібних його ділянок. Як поєднати те й інше - закартировано великий район, але детально?

Сучасна стратегія заповнення прогалин - прогулянка по хромосомі. Її починають з якогось короткого ділянки, чия нуклеотидних послідовність вже розшифровано. По ній синтезують праймер, гібрідізіруют його з першим ліпшим клоном з невпорядкованою геномної бібліотеки, а потім "підключають до справи" полімеразу - вона робить ланцюг, комплементарних даного клону. Потім цей ланцюг секвеніруют, а її хвостик використовують як праймера для наступного кроку по хромосомі.

От і прозвучало слово "секвенування". Так називається новітній, прославлений, найдокладніший, найточніший ... і, з дозволу сказати, тягомотно метод картування геному. Його сутність - повна розшифровка послідовності нуклеотидів. Щоб у деталях пояснити, як вона здійснюється, потрібна була б двогодинна лекція з молекулярної біології. Тому в двох словах: з бібліотеки клонів витягують фрагмент
ДНК, знову клонують, а що вийшли копії хімічно перетворять в набір відрізків ДНК, що розрізняються по довжині лише на один нуклеотид (ось саме цю стадію практично неможливо описати загальнодоступним мовою - настільки вона складна навіть для генетика-професіонала). Потім згадані відрізки поділяються на гелевою платівці в пульсуючому електромагнітному полі
(пульс-форез). Послідовність нуклеотидів читають по фореграмме: кожен відрізок "їде" по гелевою платівці настільки далеко, наскільки велика його довжина, і займає місце в одному з чотирьох стовпців - залежно від того, на якій нуклеотид (а їх всього чотири типи) він довший сусіднього.

Хоча сучасні удосконалення дозволяють вивчати одночасно до
40 клонів на одному гелі, витрати часу та коштів все одно величезні. Навіть досвідчена робоча група на кращому обладнанні секвеніруют в рік не більше
100 000 п.н. на рік. Якщо прийняти вартість аналізу кожної пари основ за долар - весь геном людини може бути секвенований за 3000 років, і обійдеться його вивчення в 3 мільярди доларів. Сума за теперішніх часів цілком прийнятна хоча б на слух, але от час ... Зараз, правда, розвиваються технології секвенування другого покоління - високовольтний капілярний електрофорез, іонізаційна резонансна спектроскопія. Вони прискорюють процес на порядок - стало бути, вистачить трьох століть (за ті ж гроші). Обнадіює, але не занадто.

По всій видимості, програма "Геном людини" буде успішно виконана лише за технологіями третього покоління, нині існуючих в зародковому стані. До них зокрема, відноситься пряме читання послідовності нуклеотидів за допомогою скануючої тунельної або атомної мікроскопії.
Сьогоднішня наука робить ставку саме на такі методи - інакше прогулянка по людським хромосомами загрожує затягнутися на тисячоліття.

Висновок

І ось на очі мені попалася журнальна замітка, датована березнем 2000 року, про те, що розшифровано послідовність ДНК 22-й людської хромосоми. Це перша найбільш повна розшифровка цілої структури в генетичному апараті людини і - 1/23 частина глобального проекту "Геном людини". Вражають масштаби колективного авторства - 216 вчених з
Великобританії, США, Японії, Канади та Швеції. Тільки ця хромосома містить більше 20 генів, зміни в яких приводять до відомих захворювань людини, зокрема (імовірно), і один з генів, що обумовлюють шизофренію. Для повного розкриття генома людини трудитися ще доведеться довго. Однак, на думку керівника геномного проекту Френсіса Коллінза, нинішнє досягнення можна вже порівняти з "розщепленням атома або польотом на
Місяць".
Жуль Верн у своєму романі "20 тисяч льє під водою" передбачав створення машини, що дозволяє людині вивчати морські глибини. Тепер батискафами, винайденими Жаком Івом Кусто, користується весь світ, удосконалюючи знання про морській флорі і фауні. У 1990 році Гаррі Гарріссон в романі "Рятувальна шлюпка" описав створення сильних, здорових, але генетично пригнічених рабів. А тепер ...
Може людству варто задуматися над іншими наслідками розшифровки генома людини, крім викорінення спадкових захворювань. Адже не рівна година, коли вони, ці наслідки

Сторінки: 1 2 3

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар