Реферати » Реферати з біології » Клонування

Клонування

vitro (поза організмом в живильному середовищі) клітини нирки, легені і шкіри дорослих тварин і використовувати вже ці клітини як донорів ядер. Приблизно
25% первинно реконструйованих яйцеклітин розвивалися до стадії бластули.
При серійних пересадках вони розвивалися до стадії плаваючого пуголовка.
Таким чином, було показано, що клітини трьох різних тканин дорослого хребетного (X. laevis) містять ядра, які можуть забезпечити розвиток принаймні до стадії пуголовка.
У сною чергу ДіБерардіно і Хофнер використовували для трансплантації ядра недслящіхся і полносгью диференційованих клітин крові - еритроцитів жаби Rana pipiens. Після серійної пересадки таких ядер 10% реконструйованих яйцеклітин досягали стадії плаваючого пуголовка.
Однак навіть за допомогою багаторазових серійних пересадок (більше 100 клітинних циклів) реконструйовані яйцеклітини далі стадії пуголовка не розвивалися.
Таким чином, у багатьох роботах показано, що у разі амфібій донорами ядер можуть бути лише зародки на ранніх стадіях розвитку. Деякі автори називають подібні експерименти клонуванням амфібій, хоча правильніше називати їх клонуванням ембріонів амфібій, так як в цьому випадку ми розмножуємо безстатевим шляхом не дорослі тварин, а зародків.
Диференціація клітин в ході розвитку хребетних супроводжується інактивацією непрацюючих генів. Тому клітини втрачають тотіпотентность, диференціювання стає незворотною. Зрештою у одних клітин відбувається повне репресування геному, в інших - у тій чи іншій мірі деградує ДНК, а в деяких випадках руйнується навіть ядро. Однак поряд з диференційованими Кочетков культивовані in vitro клітинні популяції містять малодиференційовані стовбурові клітини, які й можуть бути використані як донори ядер для клонування ссавців.
Досліди з амфібіями показали, що ядра різних типів клітин одного і того ж організму генетично ідентичні і в процесі клітинної диференціювання поступово втрачають здатність забезпечувати розвиток реконструйованих яйцеклітин, однак серійні пересадки ядер і культивування клітин in vitro в якій-то мірі збільшує цю здатність.
Невдачі експериментів з мишами
Успішні досліди з амфібіями змусили вчених задуматися про клонування ембріонів ссавців, зокрема мишей. МакКіннел в одній зі своїх робіт зазначав, що всі необхідні для цього методи вже існують, і незрозуміло, чому миша до цих пір не клонована. На його думку, першими об'єктами повинні були стати саме дрібні тварини, такі як миша або кролик. Однак пророкування МакКиннелла не збулося, хоча наприкінці 70-х років досліди на мишах дійсно почалися і протікали дуже драматично. До того часу, зауважу, дуже грунтовно були вивчені біологія і генетика ранніх етапів розвитку ссавців, і, зокрема, миші як модельного об'єкта.
Робота методично виявилася досить важким, насамперед тому, що обсяг яйцеклітини у ссавців приблизно в тисячу разів менше, ніж у амфібій. Однак ці труднощі були успішно подолані. Експериментатори навчилися мікрохірургічних видаляти пронуклеус з зигот (запліднених яйцеклітин) миші і пересаджувати в них клітинні ядра ранніх ембріонів.
Проте всі отримані різними способами зародки мишей розвивалися лише до стадії бластоцисти.
Пронуклеус - одне з двох гаплоїдних ядер в яйці ссавців у період після проникнення сперматозоїда, але до злиття чоловічого і жіночого пронуклеусов в ядро ??зиготи в процесі запліднення. Чоловіче ядро ??формується з ядерного матеріалу сперматозоїда, жіноче - з хромосом яйцеклітини.
Бластоциста (бластула) - зародок ссавців на одній з ранніх стадій розвитку, ще до його імплантації в матку.
У 1977 році з'явилося сенсаційне повідомлення Хоппе і Ілменсі про те, що вони отримали сім дорослих самок мишей, п'ять з яких мали голько магерінскій, а два - батьківський геном. Це, нібито, залежало від гого, який пронуклеус був залишений в яйці - жіночий або чоловічий, він і визначав розвиток особини але типу гиногенеза або андрогенеза. Їх успіх був пов'язаний, але описом авторів, з гем, що, видаляючи один нронуклеус, вони подвоювали число хромосом іншого, обробляючи яйця спеціальною речовиною, потім вирощували отримані диплоїдні гомочіготние (з двома однаковими наборами генів) зародки in vitro до стадії бластоцисти і пересаджували в матку самки-реципієнта для подальшого розвитку.
Здавалося, тепер можна буде швидко отримувати ссавців зі 100%-ної гомозиготностью по всіх генам. Це особливо важливо в селекції, так як для отримання сільськогосподарських тварин, зокрема, великої рогатої худоби, із закріпленими особливо цінними якостями звичайними прийомами потрібні десятки років роботи.
Однак, на жаль, дані Хоппе і Ілменсі підтвердити не вдалося, хоча багато хто намагався це зробити. Виявилося, що отримані будь-яким способом диплоїдні андрогенетичним та гіногенетіческіе зародки мишей гинуть на тих же стадіях, що і диплоїдні партеногенетические (що розвиваються з незаплідненої яйцеклітини) ембріони.
Значно удосконаливши методи добування ядер і введення їх в клітку,
МакГрат і Солтер провели свою серію експериментів і повідомили, що високий вихід живих мишей вони отримали, коли як донорів ядер використовували зиготи, але якщо донорами були ранні ембріони, то реконструйовані яйцеклітини, як і раніше, розвивалися лише до стадії бластоцисти.
Метод МакГрата і Солтер став широко використовуватися різними експериментаторами. Так, Манн і ловель-Бадж виділяли пронуклеус з яєць, активованих до партеногенезу, і пересаджували їх енуклеірованние зиготи мишей. У цих випадках ембріони гинули на ранніх стадіях. Якщо ж навпаки, пронуклеус отримували з запліднених яєць і пересаджували в партеногенетически активовані та позбавлені ядра яйця, то такі зародки розвивалися нормально до народження. Сурані з співавторами встановили, що якщо додати жіночий пронуклеус з зиготи миші до гаплоидному набору хромосом яйцеклітини, то нормального розвитку не відбувається, додавання ж чоловічого ядра призводить до нормального розвитку. З іншого боку, рекомбінації чоловічого і жіночого пронуклеус з різних запліднених яйцеклітин мишей забезпечує нормальний розвиток, а комбінація двох чоловічих або двох жіночих пронуклеус зупиняє розвиток ембріона.
Ці досліди показали, що для нормального розвитку ссавців потрібні два набори хромосом - батьківський і материнський. Тому ні у одного з відомих видів ссавців не описаний партеногенез. Тому роботи Хоппе і Ілменсі не вдалося повторити.
Однак ці дослідники ще двічі розбурхували наукове співтовариство. У 1982 році вони пересадили ядра клітин партеногенетических бластоцист мишей венуклеірованние зиготи Деякі з цих реконструйованих яйцеклітин нормально розвивалися, і нібито були отримані чотири дорослих самки. У світлі вищесказаного ці результати досить малоймовірні.
Загибель партеногенетических (гіногенетіческіх) і андрогенетических зародків у ссавців пов'язана з різною активністю в онтогенезі материнського і батьківського геномів. Механізм, який регулює ці функціональні відмінності, був названий геномних импринтингом і вивчався у ряді робіт, де було показано, що для нормального розвитку ссавців потрібна наявність чоловічого геному. Інша стаття Ілменсі і Хоппе мала ще більший резонанс.
Автори повідомили про пересадку ядер клітин внутрішньої клітинної маси бластоцисти венуклеірованние зиготи мишей та одержання трьох дорослих мишей
(двох самок і самця), генетично ідентичних донорської лінії мишей.
Введення ядер-донорів та видалення пронуклеус з зиготи проводили за прийом, потім реконструйовані яйцеклітини культивували in vitro до стадії бластоцисти і пересаджували в матку самок. З 16-ти пересаджених бластоцист три розвинулися у дорослих тварин. У наступній роботі (1982) ці ж автори використовували як донорів ядер клітини ембріонів ще більш пізніх стадій (7 діб) і нібито отримали трьох статевозрілих мишей.
Однак ніхто з працюючих у тому ж напрямку не зміг домогтися подібних результатів, і достовірність даних Ілменсі і Хоппе була знову поставлена ??під сумнів.
МакГрат і Солтер показали, що ядра 8-клітинних зародків і клітин внутрішньої клітинної маси бластоцисти не забезпечують розвиток in vitro реконструйованих яйцеклітин навіть до стадії морули, що передує стадії бластоцисти. Невелика частина (5%) ядер 4-клітинних зародків дає можливість розвиватися тільки до стадії морули. Водночас 19% реконструйованих яйцеклітин, що містять ядра 2-клітинних зародків, змогли досягти стадії морули або бластоцисти.
Ці та багато інших дані показують, що в ембріогенезі у мишей клітинні ядра рано втрачають тотіпотентность, що пов'язано очевидно, з дуже ранньої активацією геному зародка - вже на стадії 2-х клітин. У інших ссавців, зокрема, у кроликів, овець і великої рогатої худоби, активація першої групи генів в ембріогенезі відбувається пізніше, на 8-16 - клітинної стадії. Можливо тому перші значні успіхи в клонування ембріонів були досягнуті на інших видах ссавців, а не на мишах. Проте, роботи з мишами, незважаючи на їх непросту долю, значно розширили наші уявлення про методологію клонування ссавців.
Кролики, корови і свині
Американські ісследонателі Стік і роблю, використовуючи методику МакГрата і
Солтера, отримали 6 живих кроликів, пересадивши ядра 8клеточних ембріонів однієї породи в позбавлені ядра яйцеклітини кроликів іншої породи. Фенотип народжених цілком відповідав фенотипу донора.
Однак тільки 6 з 164 реконструйованих яйцеклітин (3,7%) розвинулися в нормальних тварин. Це, звичайно, дуже низький вихід, практично не дозволяє розраховувати на отримання таким методом клону генетично ідентичних тварин. Цінність цієї роботи тим не менш в тому. що вона показала можливість клонування ембріонів кроликів.
Робота з реконструйованими яйцеклітинами великих домашніх тварин, корів чи овець, йде трохи по-іншому. Їх спочатку культивують НЕ in vitro, a in vivo - у перев'язаному яйцепровід вівці - проміжного (першого) реципієнта. Потім їх звідти вимивають і трансплантують в матку остаточного (другого) реципієнта -

Сторінки: 1 2 3 4 5

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар