Головна
Реферати » Реферати з біології » Клонування

Клонування

Клонування

Термін "клон" походить від грецького слова "klon", що означає - гілочка, втеча, держак, і має відношення, перш за все до вегетативного розмноження. Клонування рослин живцями, нирками чи бульбами в сільському господарстві, зокрема в садівництві, відомо вже більше 4-х тис. років. При вегетативному розмноженні і при клонуванні гени розподіляються по нащадкам, як у випадку статевого розмноження, а зберігаються в повному складі протягом багатьох поколінь.

Однак у тварин є перешкода. У міру зростання їх клітин, вони в ході клітинної спеціалізації - диференціювання - втрачають здатність реалізовувати всю генетичну інформацію, закладену в ядрі

Втім, виявляється, є ящірки-стрибуни, які споконвіку розмножуються саме клонуванням, так як у них в роду є тільки самки.

Хоча це не зовсім клонування, це називається партогенез. Ця зустрічається в природі (перш за все у безхребетних) форма одностатевого розмноження передбачає розвиток яйцеклітин без запліднення.
Експерименти по штучному провокування партеногенезу почалися ще наприкінці XIX століття (роботи російського зоолога Тихомирова). Надалі вчені, застосовуючи різні фізико-хімічні подразники, такі як розчини сильних кислот, тертя, нагрівання, зуміли отримати партеногенез у багатьох тварин, у тому числі ссавців

Можливість клонування ембріонів хребетних вперше була показана на початку 50-х років в дослідах на амфібія. Досліди з ними показали, що серійні пересадки ядер і культивування клітин in vitro в якійсь мірі збільшує цю здатність.

Вже на початку 90-х була вирішена і проблема клонування ембріональних клітин ссавців. Реконструйовані яйцеклітини великих домашніх тварин, корів чи овець спочатку культивують НЕ in vitro, a in vivo - у перев'язаному яйцепровід вівці - проміжного (першого) реципієнта. Потім їх звідти вимивають і трансплантують в матку остаточного (другого) реципієнта - корови чи вівці відповідно, де їх розвиток відбувається до народження дитинча.

Стаття Уилмута з співавторами, що з'явилася на початку 1997 року, стала сенсаційною саме тому, що вперше клонального тварина (вівця на прізвисько
Доллі) з'явилося в результаті використання донорського ядра клітини молочної залози дорослої вівці. У цього першого успішного експерименту є істотний недолік - дуже низький коефіцієнт виходу живих особин
(0,36%). Однак він доводить можливість повноцінного клонування, (або отримання копії дорослої людини). Залишається лише вирішити технічні та етичні питання.

Найцікавіше, що методологія клонування, використана
Уилмут, була підготовлена ??в СРСР ще в 1987-му році, але в Академії наук на це прореагували мляво - не до того, видимо ...

Перші досліди на амфібія

Можливість клонування ембріонів хребетних вперше була показана на початку 50-х років в дослідах на амфібія. Американські дослідники Бріггс і
Кінг мікрохірургічних метод пересадки ядер ембріональних клітин за допомогою тонкої скляної піпетки в позбавлені ядра
(енуклеірованние) яйцеклітини. Вони встановили, що якщо брати ядра з клітин зародка на ранній стадії його розвитку - бластуле, то приблизно в 80% випадків зародок благополучно розвивається далі і перетворюється на нормального пуголовка. Якщо ж розвиток зародка, донора ядра, просунулася на наступну стадію - гаструлу, то лише менш ніж у 20% випадків оперовані яйцеклітини розвивалися нормально. Ці результати пізніше були підтверджені і в інших роботах.

Великий внесок у цю область вніс англійський біолог Гердон. Він першим в дослідах з південноафриканськими жабами Xenopus laevis (1962) в якості донора ядер використав не зародкові клітини, а вже цілком спеціалізувалися клітини епітелію кишечника плаваючого пуголовка. Ядра яйцеклітин реципієнтів він не видаляв хірургічним шляхом, а руйнував ультрафіолетовими променями. У більшості випадків реконструйовані яйцеклітини не розвивалися, але приблизно десята частина з них утворювала ембріони. 6,5% з цих ембріонів досягали стадії бластули, 2,5% - стадії пуголовка і тільки 1% розвинувся в статевозрілих особин (рис. 1). Однак поява кількох дорослих особин в таких умовах могло бути пов'язано з тим, що серед клітин епітелію кишечника розвивається пуголовка досить тривалий час присутні первинні статеві клітини, ядра яких могли бути використані для пересадки. У наступних роботах як сам автор, так і багато інших дослідників не змогли підтвердити дані цих перших дослідів.

Пізніше Гердон модифікував експеримент. Оскільки більшість реконструйованих яйцеклітин (з ядром клітини кишкового епітелію) гинуть до завершення стадії гаструли, він спробував витягнути з них ядра на стадії бластули і знову пересадити їх у нові енуклеірованние яйцеклітини (така процедура називається "серійної пересадкою", на відміну від "первинної пересадки" ). Число зародків з нормальним розвитком після цього збільшувалася, і вони розвивалися до більш пізніх стадій в порівнянні з зародками, отриманими в результаті первинної пересадки ядер.

Потім Гердон разом з Ласки (1970) стали культивувати in vitro (поза організмом в живильному середовищі) клітини нирки, легені і шкіри дорослих тварин і використовувати вже ці клітини як донорів ядер. Приблизно
25% первинно реконструйованих яйцеклітин розвивалися до стадії бластули.
При серійних пересадках вони розвивалися до стадії плаваючого пуголовка.
Таким чином, було показано, що клітини трьох різних тканин дорослого хребетного (X. laevis) містять ядра, які можуть забезпечити розвиток, по крайней мере, до стадії пуголовка.

У свою чергу ДіБерардіно і Хофнер використовували для трансплантації ядра неделящихся і повністю диференційованих клітин крові - еритроцитів жаби Rana pipiens. Після серійної пересадки таких ядер 10% реконструйованих яйцеклітин досягали стадії плаваючого пуголовка.
Однак навіть за допомогою багаторазових серійних пересадок (більше 100 клітинних циклів) реконструйовані яйцеклітини далі стадії пуголовка не розвивалися.

Таким чином, у багатьох роботах показано, що у разі амфібій донорами ядер можуть бути лише зародки на ранніх стадіях розвитку.
Деякі автори називають подібні експерименти клонуванням амфібій, хоча правильніше називати їх клонуванням ембріонів амфібій, так як в цьому випадку ми розмножуємо безстатевим шляхом не дорослі тварин, а зародків.

Диференціація клітин в ході розвитку хребетних супроводжується інактивацією непрацюючих генів. Тому клітини втрачають тотіпотентность, диференціювання стає незворотною. Зрештою у одних клітин відбувається повне репресування геному, в інших - у тій чи іншій мірі деградує ДНК, а в деяких випадках руйнується навіть ядро. Однак поряд з диференційованими Кочетков культивовані in vitro клітинні популяції містять малодиференційовані стовбурові клітини, які й можуть бути використані як донори ядер для клонування ссавців.

Досліди з амфібіями показали, що ядра різних типів клітин одного і того ж організму генетично ідентичні і в процесі клітинної диференціювання поступово втрачають здатність забезпечувати розвиток реконструйованих яйцеклітин, однак серійні пересадки ядер і культивування клітин in vitro в якій-то мірі збільшує цю здатність.

Невдачі експериментів з мишами

Успішні досліди з амфібіями змусили вчених задуматися про клонування ембріонів ссавців, зокрема мишей. МакКіннел в одній зі своїх робіт зазначав, що всі необхідні для цього методи вже існують, і незрозуміло, чому миша до цих пір не клонована. На його думку, першими об'єктами повинні були стати саме дрібні тварини, такі як миша або кролик. Однак пророкування

МакКиннелла не збулося, хоча наприкінці 70-х років досліди на мишах дійсно почалися і протікали дуже драматично. До того часу, зауважу, дуже грунтовно були вивчені біологія і генетика ранніх етапів розвитку ссавців, і, зокрема, миші як модельного об'єкта.

Робота методично виявилася досить важким, насамперед тому, що обсяг яйцеклітини у ссавців приблизно в тисячу разів менше, ніж у амфібій. Однак ці труднощі були успішно подолані. Експериментатори навчилися мікрохірургічних видаляти пронуклеус з зигот (запліднених яйцеклітин) миші і пересаджувати в них клітинні ядра ранніх ембріонів.
Проте всі отримані різними способами зародки мишей розвивалися лише до стадії бластоцисти.

У 1977 році з'явилося сенсаційне повідомлення Хоппе і Ілменсі про те, що вони отримали сім дорослих самок мишей, п'ять з яких мали тільки материнський, а два - батьківський геном. Це, нібито, залежало від того, який пронуклеус був залишений в яйці - жіночий або чоловічий, він і визначав розвиток особини по типу гиногенеза або андрогенеза. Їх успіх був пов'язаний, але описом авторів, з тим, що, видаляючи один пронуклеус, вони подвоювали число хромосом іншого, обробляючи яйця спеціальною речовиною, потім вирощували отримані диплоїдні гомозиготні (з двома однаковими наборами генів) зародки in vitro до стадії бластоцисти і пересаджували в матку самки-реципієнта для подальшого розвитку.

Здавалося, тепер можна буде швидко отримувати ссавців зі 100%-ної гомозиготностью по всіх генам. Це особливо важливо в селекції, так як для отримання сільськогосподарських тварин, зокрема, великої рогатої худоби, із закріпленими особливо цінними якостями звичайними прийомами потрібні десятки років роботи.

Однак, на жаль, дані Хоппе і Ілменсі підтвердити не вдалося, хоча багато хто намагався це зробити. Виявилося, що отримані будь-яким способом диплоїдні андрогенетичним та гіногенетіческіе зародки мишей гинуть на тих же стадіях, що і диплоїдні партеногенетические (що розвиваються з незаплідненої яйцеклітини) ембріони.

Значно удосконаливши методи добування ядер і введення їх в клітку, МакГрат і Солтер провели свою серію експериментів і повідомили, що високий вихід живих мишей вони отримали, коли як донорів

Сторінки: 1 2 3 4 5