Головна
Реферати » Реферати з біології » Клонування

Клонування

ядер використовували зиготи, але якщо донорами були ранні ембріони, то реконструйовані яйцеклітини, як і раніше, розвивалися лише до стадії бластоцисти.

Метод МакГрата і Солтер став широко використовуватися різними експериментаторами. Так, Манн і ловель-Бадж виділяли пронуклеус з яєць, активованих до партеногенезу, і пересаджували їх енуклеірованние зиготи мишей. У цих випадках ембріони гинули на ранніх стадіях. Якщо ж навпаки, пронуклеус отримували з запліднених яєць і пересаджували в партеногенетически активовані та позбавлені ядра яйця, то такі зародки розвивалися нормально до народження. Сурані з співавторами встановили, що якщо додати жіночий пронуклеус з зиготи миші до гаплоидному набору хромосом яйцеклітини, то нормального розвитку не відбувається, додавання ж чоловічого ядра призводить до нормального розвитку. З іншого боку, рекомбінації чоловічого і жіночого пронуклеус з різних запліднених яйцеклітин мишей забезпечує нормальний розвиток, а комбінація двох чоловічих або двох жіночих пронуклеус зупиняє розвиток ембріона.

Ці досліди показали, що для нормального розвитку ссавців потрібні два набори хромосом - батьківський і материнський. Тому ні у одного з відомих видів ссавців не описаний партеногенез. Тому роботи Хоппе і Ілменсі не вдалося повторити.

Однак ці дослідники ще двічі розбурхували наукове співтовариство. В
1982 вони пересадили ядра клітин партеногенетических бластоцист мишей венуклеірованние зиготи. Деякі з цих реконструйованих яйцеклітин нормально розвивалися, і нібито були отримані чотири дорослих самки. У світлі вищесказаного ці результати досить малоймовірні.

Загибель партеногенетических (гіногенетіческіх) і андрогенетических зародків у ссавців пов'язана з різною активністю в онтогенезі материнського і батьківського геномів. Механізм, який регулює ці функціональні відмінності, був названий геномних импринтингом і вивчався у ряді робіт, де було показано, що для нормального розвитку ссавців потрібна наявність чоловічого геному. Інша стаття Ілменсі і Хоппе мала ще більший резонанс.

Автори повідомили про пересадку ядер клітин внутрішньої клітинної маси бластоцисти венуклеірованние зиготи мишей та одержання трьох дорослих мишей
(двох самок і самця), генетично ідентичних донорської лінії мишей.
Введення ядер-донорів та видалення пронуклеус з зиготи проводили за прийом, потім реконструйовані яйцеклітини культивували in vitro до стадії бластоцисти і пересаджували в матку самок. З 16-ти пересаджених бластоцист три розвинулися у дорослих тварин. У наступній роботі (1982) ці ж автори використовували як донорів ядер клітини ембріонів ще більш пізніх стадій (7 діб) і нібито отримали трьох статевозрілих мишей.
Однак ніхто з працюючих у тому ж напрямку не зміг домогтися подібних результатів, і достовірність даних Ілменсі і Хоппе була знову поставлена ??під сумнів.

МакГрат і Солтер показали, що ядра 8-клітинних зародків і клітин внутрішньої клітинної маси бластоцисти не забезпечують розвиток in vitro реконструйованих яйцеклітин навіть до стадії морули, що передує стадії бластоцисти. Невелика частина (5%) ядер 4-клітинних зародків дає можливість розвиватися тільки до стадії морули. Водночас 19% реконструйованих яйцеклітин, що містять ядра 2-клітинних зародків, змогли досягти стадії морули або бластоцисти.

Ці та багато інших дані показують, що в ембріогенезі у мишей клітинні ядра рано втрачають тотіпотентность, що пов'язано, очевидно, з дуже ранньої активацією геному зародка - вже на стадії 2-х клітин. У інших ссавців, зокрема, у кроликів, овець і великої рогатої худоби, активація першої групи генів в ембріогенезі відбувається пізніше, на 8-16 - клітинної стадії. Можливо тому перші значні успіхи в клонування ембріонів були досягнуті на інших видах ссавців, а не на мишах. Проте, роботи з мишами, незважаючи на їх непросту долю, значно розширили наші уявлення про методологію клонування ссавців.

Кролики, корови і свині

Американські дослідники Стік і роблю, використовуючи методику МакГрата і
Солтера, отримали 6 живих кроликів, пересадивши ядра 8клеточних ембріонів однієї породи в позбавлені ядра яйцеклітини кроликів іншої породи. Фенотип народжених цілком відповідав фенотипу донора.

Однак тільки 6 з 164 реконструйованих яйцеклітин (3,7%) розвинулися в нормальних тварин. Це, звичайно, дуже низький вихід, практично не дозволяє розраховувати на отримання таким методом клону генетично ідентичних тварин. Цінність цієї роботи, тим не менш, в тому, що вона показала можливість клонування ембріонів кроликів.

Робота з реконструйованими яйцеклітинами великих домашніх тварин, корів чи овець, йде трохи по-іншому. Їх спочатку культивують НЕ in vitro, a in vivo - у перев'язаному яйцепровід вівці - проміжного (першого) реципієнта. Потім їх звідти вимивають і трансплантують в матку остаточного (другого) реципієнта - корови чи вівці відповідно, де їх розвиток відбувається до народження дитинча. Уіладсін запропонував укладати реконструйовані яйцеклітини в агарових циліндр, який він потім трансплантували в перев'язаний яйцепровід вівці. За даними одних авторів реконструйовані зародки краще розвиваються в яйцеклітині, ніж у культуральної середовищі, хоча деякі дослідники отримали непогані результати і при культивуванні.

Американці Роблю і його працівники, використовуючи щадний метод вилучення ядра без проколювання мембрани яйцеклітини, запропонований МакГрат і
Солтером, пересаджували в зиготи так звані каріопласти - чоловічий і жіночий пронуклеуси разом з навколишнім їх цитоплазмою, а також ядра 2-, 4 - або 8-клітинних ембріонів корови. Спочатку зиготи центрифугировали, щоб звільнити пронуклеуси від оточуючих їх гранул жовтка, після чого ядра було добре видно під мікроскопом, що значно полегшувало їх видалення. За допомогою маніпулятора і загостреною скляній микропипетки витягували один з бластомерів разом з ядром з ранніх зародків і переносили його в енуклеірованную зиготу.

Реконструйовані зародки були укладені в агарових циліндр і пересаджені в перев'язаний яйцепровід вівці. Через п'ять днів культивування їх вимивали, звільняли від агару і досліджували. Реконструктурірованние зародки в цій роботі розвивалися лише в тих випадках, коли в зиготи пересаджували пронуклеус: 17% таких зародків досягли стадії морули або бластоцисти. Два зародка були пересаджені другу реципієнту - в матку корови, і розвиток їх завершилося народженням живих телят. Якщо в якості донорів використовували ядра 2-, 4 - або 8-клітинних зародків, то реконструйовані яйцеклітини не розвивалися до стадії морули.

Пізніше були і більш успішні роботи. Уіладсін, зокрема, повідомив, що йому вдалося отримати чотирьох генетично ідентичних бичків холстейнской породи в результаті пересадки в реціпіентние яйцеклітини ядер бластомерів одного 32-клітинного зародка (рис. 3). Автор стверджував, що більшість ядер зберігає тотіпотентность на 32-клітинній стадії, а значна їх частина навіть на 64-клітинній стадії, забезпечуючи нормальний розвиток реконструйованих яйцеклітин до стадії ранньої бластоцисти в яйцепровід вівці.
Після пересадки в матку корів - остаточних реципієнтів, як вважає автор, вони можуть і далі нормально розвиватися.

Бондіолі і співавтори, використовуючи як донорів ядер 16-64-клітинні зародки корів, трансплантували 463 реконструйованих зародка в матку синхронізованих реципієнтів, і було отримано 92 живих теляти. Сім з них були генетично ідентичні, бувши клон, отриманий в результаті пересадки ядер клітин одного донорського ембріона.

Таким чином, клітинні ядра зародків великої рогатої худоби досить довго зберігають тотіпотентность і можуть забезпечити повний розвиток реконструйованих яйцеклітин. Інакше кажучи, методичні труднощі клонування зародків великої рогатої худоби практично вирішені. Але залишається основне завдання - знайти донорські ядра, що володіють тотипотентностью, для клонування дорослих тварин.

Клонування ембріонів свиней присвячена тільки одна невелика робота.
Убогість даних, мабуть, і пов'язана з певними труднощами роботи з цим об'єктом.

Клонування овець

Уіладсін ще в 1986 році показав, що і в ембріонів овець на 16 - клітинної стадії розвитку ядра зберігають тотіпотентность.
Реконструйовані яйцеклітини, які містять ядра бластомерів 16-клітинних зародків, розвивалися нормально до стадії бластоцисти в перев'язаному яйцепровід вівці (в агарових циліндрі), а після звільнення від агару і пересадки в матку вівці - другий реципієнта - ще 60 днів. В іншому випадку донорами служили ядра 8-клітинних зародків і були отримані 3 живих ягняти, фенотип яких відповідав породу овець - донорів.

У 1989 році Сміт і Уилмут трансплантували ядра клітин 16-клітинного ембріона і ранньої бластоцисти в позбавлені ядра незапліднені яйцеклітини овець. У першому випадку було отримано два живих ягняти, фенотип яких відповідав породу овець - донорів ядер. У другому випадку один повністю сформувався ягня загинув під час пологів. Його фенотип також відповідав породу - донору. Автори вважали, що в ході диференціювання ембріональних клітин відбувається інактивація деяких важливих для розвитку генів, в результаті якої ядра бластоцисти вже не можуть репрограммироваться в цитоплазмі яйцеклітини і забезпечити нормальний розвиток реконструйованого зародка. Тому, на думку авторів, як донорів ядер краще використовувати 16-клітинні ембріони або культивовані in vitro лінії ембріональних клітин, ядра яких мають тотипотентностью.

Пізніше, в 1993-1995 роках, група дослідників під керівництвом
Уилмута отримала клон овець - 5 ідентичних тварин, донорами ядер яких була культура ембріональних клітин. Клітинну культуру отримували наступним чином: виділяли мікрохірургічних ембріональний диск з 9-денного овечого ембріона (бластоцисти) і культивували клітини in vitro протягом багатьох пасажів (принаймні до 25). Спочатку клітинна культура нагадувала культуру стовбурових недиференційованих ембріональних клітин, але незабаром, після 2-3-х пасажів, клітини ставали ущільненими і морфологічно подібними з епітеліальними. Ця лінія клітин з 9-денного зародка вівці була позначена як

Сторінки: 1 2 3 4 5