Головна
Реферати » Реферати з біології » Дослідження клітинного циклу методом проточної цитометрії

Дослідження клітинного циклу методом проточної цитометрії

Білоруський державний університет

Біологічний факультет кафедра генетики і біотехнології

ДОСЛІДЖЕННЯ клітинного циклу методом проточної цитометрії

Курсова робота

студентки 3 курсу ШУТ М .В.

Науковий керівник:

канд. біол. наук,

доцент глушити С. В.

Мінськ 2001р.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВСТУП ... ..3

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ ... 4

1.Загальні принципи проточної цитометрії ... ... ..4

2. Аналіз ДНК-гістограм ... .5

3. Аналіз параметрів клітинного циклу ... .9

4.Наіболее споживані методики, використовувані в цитометрії клітинного циклу ... ..14

5.Прімененіе цитометрії в молекулярній клінічній діагностиці ... ..17

ВИСНОВОК ... ... ..22

ЛІТЕРАТУРА ... .. 23

ВСТУП

Можливості застосування методів кількісної цитометрії в біологічних і медичних дослідженнях дуже широкі. Вони включають безліч завдань, починаючи від пошуку найбільш інформативних морфометричних і цитоспектрофотометрическому критеріїв кінетики
ДНК в клітинному циклі і кінчаючи багатопараметричних вивченням гетерогенних популяцій досліджуваних об'єктів. Хоча ці завдання можуть вирішуватися на різних експериментальних моделях або клінічному матеріалі, загальні принципи залишаються однаковими як для тих, так і інших об'єктів.

В даний час цитометрию прийнято поділяти на проточну і статичну. Перший варіант цитометрії здійснюється за допомогою спеціальних приладів - проточних цитометров і сортерів. Для статичної цитометрії можуть бути використані конфокальні мікроскопи, а також більш прості і дешеві системи аналізу зображень, змонтовані на звичайних люмінесцентних мікроскопах.
Існує багато методик, які з однаковим успіхом можна відтворювати як за допомогою проточної, так і статичної цитометрії. Більш того, статична цитометрия в деяких випадках дозволяє отримати більш широку інформацію про клітини, причому її продуктивність не набагато менше проточної.

Справжній огляд літератури присвячений застосуванню цитометрії для оцінки параметрів клітинного циклу на експериментальному і клінічному матеріалі. Хоча в огляді переважно наводяться відомості, що стосуються проточної цитометрії, з урахуванням викладеного вище вони в значній мірі поширюються також і на статичну цитометрию.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.Загальні принципи проточної цитометрії
Метод проточної цитометрії сформувався за останні 30 років на основі окремих дослідів з підрахунку числа частинок і визначенню їх розмірів. У 1965 р з'явилося перше повідомлення про клітинному СОРТЕР, а в 70-х роках стали випускати прилади, здатні вимірювати інтенсивність флуоресценції при двох і більше довжинах хвиль і визначати відразу кілька клітинних параметрів.

В даний час випускають два основних типи приладів для проточної цитометрії: 1) прості у використанні апарати, які можуть вимірювати флуоресценцію при двох і більше довжинах хвиль і светорассеяніє під кутом близько 10є (малокутове пряме розсіювання) і
90є; 2) великі клітинні сортери, які не тільки вимірюють п'ять і більше клітинних або ядерних параметрів, але і сортують частинки з заданим набором цих параметрів.
Принципи проточної цитометрії дуже прості. Клітини або ядра поодинці перетинають сфокусований світловий пучок, зазвичай лазерний. Світло певної довжини збуджує молекули флуоресціюючих барвників, пов'язаних з різними клітинними компонентами, при цьому при цьому може відбуватися одночасне порушення кількох різних барвників, що дозволяє оцінити відразу кілька клітинних параметрів. Світло, яке випромінюється барвниками, збирають за допомогою системи лінз і дзеркал і розкладають на компоненти. Світлові сигнали детектируют, перетворять в електричні імпульси і далі в форму, зручну для комп'ютерної обробки та зберігання інформації.
Методом проточної цитометрії можна отримувати самі різні дані: визначати вміст у клітині ДНК і РНК, сумарна кількість білків і кількість специфічних білків, впізнаваних моноклональними антитілами, досліджувати клітинний метаболізм
(наприклад, вимірювати внутрішньоклітинний рН), вивчати транспорт іонів кальцію і кінетику ферментативних реакцій (MGOrmerod, 1990).
У продажу є різні проточні цитометрия, і викласти загальні принципи їх роботи складно. Можна відзначити лише кілька моментів, спільних для всіх приладів:
- для аналізу необхідні гомогенні суспензії ізольованих клітин;
- Клітини або ядра повинні бути в достатній кількості;
- Для усунення ефектів, пов'язаних з можливою агрегацією клітин, необхідно використовувати всю доступну інформацію, наприклад дані з розсіювання світла в об'ємі і відношення площі піка до його ширини.
2. Аналіз ДНК-гістограм
Вимірювання вмісту ДНК - одне з найпростіших і поширених застосувань проточної цитометрії. Перші ДНК-гістограми, отримані в 1969 г. (MAVan Dilla, TT Trujillo,
PFMullaney, JRCoulter, 1969), дозволили чітко розрізнити клітини, які знаходяться в G1-, S- і G2 / М-фазах клітинного циклу. З тих пір з'явилося безліч робіт по вимірюванню вмісту ДНК в клінічному матеріалі, отриманому в основному від хворих раком.
З ДНК-гістограм можна отримати два роду даних. По-перше, ідентифікувати клітини з аномальним вмістом ДНК (рис.1, Б), так звані анеуплоїдних клітини. По-друге, визначити частку клітин, що знаходяться в S-фазі (SPF), і оцінити ступінь проліферації.
Як правило, в клітинної популяції з високою проліферативною активністю число клітин в S-фазі більше, ніж зазвичай.

Міжнародний комітет з аналітичної цитометрії (W.Hoddeman,
J.Schumann, M.Andreeff, B.Barlogie, CJHerman, RCLief et.al,
1984) спробував стандартизувати безліч способів аналізу ДНК-гістограм, і проте для аналізу продовжують використовувати різні підходи, часто з залученням комп'ютерних прграмм. Далі будуть розглянуті деякі з цих підходів:


Обчислення коефіцієнта варіації (CV)
Найпростіший спосіб оцінки якості результатів заснований на обчисленні CV для G1-піка ДНК диплоїдних клітин. Ця величина визначається з наведеного нижче співвідношення в припущенні, що
G1-пік слід нормальному розподілу:

CV = W / (M · 2,35),
Де W - ширина піка на рівні піввисоті, М - номер каналу для максимуму G1-піку.
Чим менше CV і чим краще G1-пік відповідає нормальному розподілу, тим якісніше результати. Насправді якість ДНК-гістограм, як правило, не дуже високо, і щоб судити про достовірність результатів, отриманих при клінічних дослідженнях, доводиться оцінювати середній CV і діапазон його значень.

Обчислення індексу ДНК
Індекс ДНК для «анеуплоїдних» піку (піків) на гистограммах з двома або більше G1-піками (рис.1, Б) обчислюють, орієнтуючись на
«диплоидний» G1-пік. Так, на рис. 1, Б G1-пику для пухлинних клітин відповідає вдвічі більшу кількість ДНК, ніж G1-пику диплоїдних клітин, тому індекс ДНК для нього дорівнює 2,0. Для анеуплоїдних клітин, що містять на 50% більше ДНК, ніж нормальні, індекс дорівнює 1,5. Анеуплоїдія можна виявити тільки в тих випадках, коли на гистограммах є не менше двох G1-піків. Щоб встановити, який з близько розташованих один до одного G1-піків відповідає диплоїдним клітинам зі свіжих зразків тканини, можна використовувати зовнішній ДНК-стандарт. Якщо присутні тільки диплоїдні клітини, то ІД вважають рівним 1,0.
Основна проблема при визначенні плоїдності пов'язана з трудністю виявлення малого числа анеуплоїдних стовбурових клітин.
Ще важче ідентифікувати нечисленні тетраплоїдні стовбурові клітини, оскільки такі клітини в G1-фазі за вмістом ДНК рівноцінні диплоїдним клітинам в фазі G2. Так, на відміну від рис 1,
Б, на якому чітко видно високий «тетраплоидний» пік, на рис.1, А виявляється лише слабкий пік, відповідний чотирьом гаплоидним наборам ДНК.

Визначення частки клітин, що знаходяться в S-фазі
Для визначення частки клітин в S-фазі використовується метод Байсха та ін. (H.Baisch, W.Gohde, WALinden, 1975), модифікований стосовно до анеуплоїдних клітинам. Суть методу полягає в побудові прямокутника, вписується в простір між G1- і G2-піками. Висота цього прямокутника визначається числом клітин, що припадають на 10 центральних каналів області S-фази, з якого обчислюється середнє число клітин на канал. Аналогічним способом можна визначити частку анеуплоїдних клітин в S-фазі за умови, що висоту прямокутника (рис.1, Б) можна обчислити, використовуючи ту частину гістограми, яка не перекривається з областю, що відповідає диплоїдним клітинам.

3. Аналіз параметрів клітинного циклу

Завдяки фундаментальним дослідженням у галузі експериментальної біології та клінічної медицини були отримані факти, що стосуються кінетики клітинного циклу.

До теперішнього часу вже накопичено певний досвід роботи з даного питання. Практично не існує жодного органу або тканини людського організму, експериментального тварини, який би не піддавався цитометричного або цитоспектрофотометрическому аналізу. На підставі цих даних встановлено, що вміст ДНК нормальних соматичних клітин відповідає диплоїдний набір хромосом (2с) і характеризується одним модальним класом на ДНК-гистограмме. Значення цього параметра для одного і того ж індивіда може коливатися в межах
30%. Найбільш виражені варіації у змісті ДНК спостерігаються в клітинах пролиферирующих органів - печінки і селезінки. Ці дані були отримані при визначенні змісту ДНК в ядрах клітин різних органів і тканин фенотіческі здорових людей (130 проб - по 5 - 14 від кожного випадку) (E.Muller, R.Weidhase, 1983).
В досліджуваних об'єктах схематично представлені фази мітотичного циклу і розподіл ДНК в різних тканинах.
Розраховувалася кінетика клітинної проліферації, а в патологічно зміненому органі - ступінь вираженості процесу, особливо в разі ракової пухлини.
Завдяки використанню в дослідженнях скануючих і проточних цитофотометрія визначено важливі дані, що стосуються класифікації клітин за фазами мітотичного циклу, а також отримані результати, що дозволяють оцінити тривалість і дисперсію відповідних фаз циклу G1, S, G2 + M.
Однопараметричним аналіз кінетики клітинного циклу з вивчення вмісту ДНК показав можливості кількісної цитометрії і відкрив широкі перспективи щодо його використання для дослідження та поглиблення знань по досліджуваному питанню.
В даний час з'явилися дані, які значно розширюють традиційне подання, що стосується розподілу клітин в чотирьох послідовних фазах циклу. Одночасне вивчення двох параметрів - ДНК і білка, ДНК і РНК - дає істотно більше інформації про кінетику клітинного циклу, тому що дозволяє розділити зливаються фази циклу, такі, як G0 + G1,
G2 + M, а

Сторінки: 1 2 3 4