Головна
Реферати » Реферати з біології » Дослідження клітинного циклу методом проточної цитометрії

Дослідження клітинного циклу методом проточної цитометрії

також ідентифікувати додаткові фази в пресинтетичному (G1 ) і постсинтетическом (G2) періодах. При аналізі Пресинтетичний періоду в експерименті та клінічному матеріалі була показана можливість використання АТ (ДНК і РНК) для додаткової класифікації G1-періоду на GIQ, GIA, GIB і G2A,
G2B (Z.Darzynkiewicz, F .Traganos, MR Melamed, 1980).
На культурі клітин Hela з використанням мічених радіоактивних ізотопів і проточної цитометрії виділені в постсинтетическом періоді клітини, що відносяться до ранньої (G2A) і пізньої (G2B) фазам клітинного циклу (OCBlair, RTWinward, JLRoti , 1979).
Pollack та ін. (A.Pollac, H.Moulis, NLBlock, GLIrvin, 1984) при цитометричного аналізі ДНК і білка (FITC / PI) в клітинах трьох різних експериментальних моделей, що включають культуру лейкозних пухлинних клітин щурів FL4, микрокультуру лімфоцитів периферичної крові людини HPBL, чи не стимульованих і стимульованих фитогемагглютинином (ФГА), а також матеріалу солідної пухлини в вигляді перевівной аденокарциноми передміхурової залози щурів R 3327 = Q показав можливість поділу Пресинтетичний періоду на три фази, виділивши в ньому покояться клітини GIQ, ранні GIA і пізні
G2B клітини, в постсинтетическом періоді були відповідно виділені ранні G2А і пізні G2B клітини. Для затримки входження клітин в S-фазу використовували актіноміцідін D, оксімочевіну, для блоку мітотичних клітин застосовували колцемідом.
У роботі також представлені дані, що свідчать про можливість класифікації пролиферирующих лімфоїдних і лейкозних пухлинних EL4-клітин в різні терміни культивування на відповідні S-фази клітинного циклу з роздільним виділенням в них M- і G2-фаз. Виходячи з представлених даних, очевидно, що проточний цитометричного аналіз за двома параметрами є одним з перспективних методів оцінки кінетики клітинного циклу, що дозволяє провести ідентифікацію клітин, що у раніше невизначених фазах циклу (G1A, G1B і G2A, G2B), і визначити клітини, які знаходяться в фазах M і G2.
В деяких роботах клінічного напрями використовується двухпараметрический аналіз клітинного матеріалу з досить успішної класифікацією патологічних процесів, наприклад при розпізнаванні доброякісних і ракових процесів сечового міхура, шийки матки, а також для класифікації різних форм гемобластозів.
У сучасній літературі вельми широко представлені дані по цитоспектрофотометрическому вивченню інтерфазних ядер. Слід зазначити, що особливу цінність представляють роботи, спрямовані на вивчення митотических клітин з наступним аналізом хромосом.
Відомо, що зміни, реєстровані в хромосомах, можуть бути визначальними діагностичними маркерами пухлини, особливо на початкових етапах виникнення злоякісного процесу. Однак використовувані методи аналізу хромосомного матеріалу порівняно складні і трудомісткі. Тому останнім часом поряд із звичайними цитогенетичними методами дослідження каріотипу нормальних і малігнізованих клітин стали застосовуватися скануючі і проточні цитометрические аналізатори. Прилади останнього типу забезпечують досить високу точність і швидкість виміру, а також відтворюваність результатів. Швидкість аналізу хромосом в протоці становить 1000 - 2000 хромосом в секунду. Проточний цитометричного аналіз ДНК метафазних хромосом в суспензії є абсолютно новим методом каріотипування. Тому в дослідженнях такого роду основний акцент робиться на розробці ефективних методів сепарації інтактних хромосом із збереженням їх цілісності та морфологічної структури.
У представлених роботах найчастіше досліджуваної моделлю є метафазні хромосоми, отримані з клітин китайського хом'ячка і людини, приготовлені для прямого кариотипирования, а також для аналізу каріотипу з короткочасним або тривалим культивуванням клітин. Для аналізу генетичного матеріалу використовуються однопараметричним проточні системи, де проводиться аналіз і сортування хромосом за інтенсивністю флуоресценції в комплексі з такими флуорохромами, як PI, EtBr, Ho 33258, а також застосовуються високоразрешающем проточної цитометрії з двухлазерной системою, які забезпечують біваріантний аналіз ДНК, мічений двома флуорохромами. Здебільшого використовують поєднання Але 33258, специфічно зв'язується з АТ-багатими ділянками ДНК, і хромомицина А3, селективно взаємодіє з ГЦ-парами.
Дані, отримані за допомогою автоматизованих систем, представляються у вигляді гістограм, так званих проточних каріограмм. Про якість аналізу свідчить високий дозвіл гістограм, Які характеризуються множинними вузькими піками, що відносяться до різних класів хромосом. Кількість піків в більшості випадків відповідає набору хромосом, яке характерно для даного індивідуума. При дослідженні клітин зародка китайського хом'ячка методом проточного кариотипирования на етапі експоненціального зростання були отримані всі 11 піків, відповідні 11 парам хромосом самки, досліджуваного тваринного
(JASteinkamp, ??1984).
Зазвичай застосовуються цитогенетичні методи не дозволяють ідентифікувати Y-хромосому з G- і F-груп хромосом людини.
Застосування проточної цитометрії дозволяє вирішити цю задачу. Так, на лімфоцитах, виділених з периферичної крові донорів-чоловіків, з короткочасним культивуванням (52 год) і добавлентем колцемідом була показана можливість визначення позиції Y-хромосоми по інтенсивності ДНК-флуоресценції (Але 33258) у вигляді піка на проточній каріограмме. У 17 обстежуваних донорів позиція Y-хромосоми на гістограмі варіювала. У деяких спостереженнях пік Y-хромосоми знаходився між 19 і 20 хромосомами, в інших - між 20-й і 17-й.
В 70% випадків Y-хромосома була контаміновані з 20-й.
З робіт, присвячених хромосомному аналізу, відомо, що при використанні однолазерний проточної системи може бути ідентифіковано близько 15 хромосом людини, виключаючи Y-хромосому.
Застосування двухлазерной системи (FACS-11) дозволяє за інтенсивністю флуоресценції розпізнати близько 20 популяцій хромосом в метафазних пластинках і, що особливо цінно, ідентифікувати маленькі аутосоми людини (M.Lalande, RRSchreck, R.Hoffman ,
SA Latt, 1985). У цьому випадку крім флюорохромів Але 33258 і хромомицина А3 в комплекс субстрат-флюорохром вводиться третій барвник: нетропсін або дістаміцін А. Це сприяє отриманню додаткової інформації про специфіку хромосом, тобто визначенню структурних особливостей нормальних і атипових хромосом. В результаті біваріантного проточного аналізу з додатковою забарвленням хромосом авторам вдалося на моделі клітинної лінії людських лимфобластов отримати високий дозвіл метафазних пластин з наступним вивченням структурної перебудови хромосом і ідентифікацією аномальних.
Проточний біваріантний аналіз, використовуваний для кариотипа хромосом, апробований на досить широкому спектрі клінічного та експериментального матеріалу, включаючи пухлину прямої кишки, культури клітин асцитичної рідини, лімфоцитів периферичної крові і фібробластів людини (VGEnchev, KGTsanev , 1985).

4.Наіболее споживані методики, використовувані в цитометрії клітинного циклу.

При проточної цитометрії можна сканувати від 100 до кількох тисяч клітин в секунду, що дозволяє дуже швидко отримати достовірні результати. Однак таким способом можна аналізувати тільки дуже розбавлені клітинні суспензії. Солідні тканини необхідно спочатку дезагреговані, що завжди супроводжується порушенням морфології. Клітини моношару зазвичай диспергируют обробкою трипсином в присутсвии ЕДТА.

Дезагрегація свіжих солідних пухлин
Методи дезагрегации клітин можна поділити на три групи:

- методи, засновані виключно на механічній обробці;

- Ферментативні методи;

- Методи виділення ядер

Найпростіші і швидкі методи дезагрегации включають тільки механічну обробку тканин. Ці методи особливо гарні для пухких тканин (наприклад, лімфатичних вузлів) і дозволяє отримувати густі суспензії клітин за кілька хвилин. Для отримання неочищених клітинних суспензій можна використовувати аспірати солідних пухлин, взяті за допомогою шприца.
Ферментативний метод дозволяє отримати досить концентровану клітинну суспензію з різноманітних пухлин, але при великих витратах часу.
Для виділення ядер (зазвичай з тканин, частково дезагреговані механічним шляхом) розроблені різні методи, засновані на використанні ферментів, детергентів або тих і інших. Детальна процедура дезагрегации тканин, фарбування препаратів, отримання результатів та їх аналізу для суспензії ядер розроблена Вінделовом та ін. (LLVindelov, IJChristensen, 1990).
Мета дезагрегации полягає в отриманні з високим виходом суспензії інтактних ізольованих клітин або ядер, досить добре відповідної вихідного зразка тканини. Вибір способу дезагрегации залежить від типу тканини, розмірів препарату, цілей дослідження, а іноді від швидкості і вартості методу.
Суспендированием архівних препаратів, залитих в парафін
Методика дослідження ДНК за допомогою проточної цитометрії суспензії ядер, отриманою з ув'язнених в парафін архівних препаратів, була вперше описана в 1983 р (DWHedley,
MLFriedlander, IWTaylor, 1983). Цю методику можна використовувати в модифікованому вигляді для аналізу найрізноманітніших пухлин.
Це дає цілий ряд переваг:

- можна проводити великі ретроспективні клінічні дослідження;

- Значно спрощується вивчення рідко зустрічаються патологій;

- Парафінові зрізи легко транспортувати, що дозволяє проводити цитометрические дослідження в спеціальних центрах.
Недоліки методу полягають у тому, що:

- якість одержуваних результатів, як правило, не дуже висока;

- Не можна використовувати внутрішній ДНК-стандарт.
Якість результатів можна підвищити, якщо трохи вдосконалити фіксацію тканин (CEGillett, RSCamplejohn,
SMOґReily, 1990). Хороший ефект дає фіксація в формаліні при нейтральному рН при 4єС протягом ночі. Слід уникати нагрівання тканини (якщо тільки воно не є абсолютно необхідним при її обробці) або невиправдано тривалої фіксації.
Фарбування ДНК
При фарбуванні клітинної ДНК з метою подальшого визначення її змісту за допомогою проточної цитометрії слід враховувати:

- специфічність барвника по відношенню до ДНК;
- Його спектральні характеристики: інтенсивність флуоресценції і можливість її реєстрації наявними у продажу приладами;

- Вартість і зручність у роботі (розчинність, стабільність і т.д.)
Цим вимогам відповідає цілий ряд флуорохромов. Детальний їх опис дано в роботах Waggoner AS (1990), Crissman H.A.,
Steincamp J.A. (1990), Laff S.A., Langolis R.J. (1990). У проточній цитометрії для фарбування ДНК частіше інших флуорохромов використовується іодістий пропідій (ІП) навіть незважаючи на те, що він не строго специфічний по відношенню до ДНК. За допомогою ІП можна фарбувати також двухцепочечную РНК. Спектральні характеристики ІП дуже зручні для проточної цитометрії: для порушення флуоресценції використовується звичайний аргоновий лазер з робочою довжиною хвилі 488 нм, а максимум флуоресценції знаходиться поблизу 620 нм, що дозволяє паралельно використовувати флуоресцеин при проведенні многопараметрических вимірів.
Незалежно від барвника останній повинен перебувати з

Сторінки: 1 2 3 4