Головна
Реферати » Реферати з біології » Дослідження клітинного циклу методом проточної цитометрії

Дослідження клітинного циклу методом проточної цитометрії

ДНК в стехиометрических співвідношеннях, т.е . кількість пов'язаного з ДНК барвника має бути пропорційно вмісту ДНК у клітині.
Щоб барвником були зайняті всі доступні для зв'язування місця, його слід брати в деякому надлишку.
Більшість флуоресціюючих барвників, що зв'язуються з ДНК, в тому числі і ІП, не можуть проходити через мембрани інтактних клітин.
Щоб підвищити проникність мембран, клітини або фіксують спиртом, або обробляють детергентами.
Використання інший ДНК в якості стандарту.
Зміст ДНК, якій відповідає один з піків на ДНК-гистограмме для досліджуваного препарату, можна оцінити, порівнявши цей пік з піком для іншої ДНК, зміст якої відомо. Так, порівняння лівого піка на рис.1 з піком, що відповідає ДНК диплоїдних лімфоцитів периферичної крові людини, говорить про те, що ми маємо справу з диплоїдними клітинами. У доповіді Комітету з номенклатурі в аналітичної цитометрії рекомендується використовувати лімфоцити як незалежного стандарту ДНК. Відомі й інші випадки, коли стандартом служать ядерні еритроцити НЕ ссавців, а інших тварин.
Якщо використовуються ядра, виділені з ув'язнених в парафін препаратів, то незалежні ДНК-стандарти застосовувати не можна. Це пов'язано з неоднаковим фарбуванням ДНК в ядрах, виділених з різних парафінових блоків, внаслідок відмінностей в процедурах фіксації й обробки тканин. Якщо на ДНК-гистограммах препаратів, укладених в парафін, спостерігається два G1-піка, то лівий з них умовно вважається відповідним диплоїдним клітинам (рис.1, Б).
Це не заважає виявленню анеуплоїдних клітин, оскільки всі зразки містять внутрішній контроль - диплоїдні клітини (лімфоцити, ендотеліальні клітини і т. Д.). Але в результаті деякі зразки помилково класифікуються як «гіперплоідние» , хоча насправді є «гіпоплоіднимі» . Клінічна значимість такої неправильної класифікації невідома, але в будь-якому випадку її ймовірність невелика.

5.Прімененіе цитометрії в молекулярній клінічній діагностиці.
На перших порах основним стимулом до розвитку проточній цитометрії послужило бажання автоматизувати цитологічні методи, що використовуються для діагнозу захворювань, але більшість опублікованих до теперішнього часу робіт присвячено застосуванню цього методу для прогностичних цілей. Інтенсивний розвиток автоматизованих діагностичних систем скануючого і проточного типів сприяло якнайшвидшому впровадженню цитометричного методу дослідження в клінічну практику. В процесі розвитку та освоєння методу відбувається його спеціалізація по трьом провідним напрямам.
Перше - це масові профілактичні огляди населення з метою виявлення ранніх стадій захворювання, друге - диференціальна діагностика прикордонних станів і злоякісного росту, третє
- контроль динаміки пухлинного захворювання в ході проведення лікарської, променевої та комбінованої терапії, а також хірургічного методу лікування. Особливо плідно ведуться цитометрические дослідження в області гематології, гінекології, урології, пульмонології, гастроентерології, метод також використовується для діагностики патологічних процесів молочної та щитовидної залоз.
З історії кількісної цитометрії відомо, що одним з перших об'єктів вивчення були формені елементи крові і епітеліальні клітини слизової оболонки шийки матки. Дана обставина пов'язана з доступністю отримання діагностичного матеріалу, різноманітністю клітинних елементів, що характеризують нормальне фізіологічне стан досліджуваних об'єктів, а також з труднощами морфологічної ідентифікації їх при різних патологічних процесах, особливо онкологічних захворюваннях.

Гінекологія
Досить великий досвід застосування кількісної цитометрії в області гінекології дозволяє виділити кілька етапів у розвитку кількісного методу оцінки морфологічних особливостей епітеліальних клітин шийки матки. Перший етап характеризується дослідженнями, в яких розглядається можливість здійснення цітоскрінінга, тобто розмежування патологічних процесів на дві групи «норма - рак» . Другий етап пов'язаний з диференціацією прикордонних станів шийки матки з аналізу одного, двох критеріїв діагностики з наступним застосуванням кореляційного аналізу, побудовою двох-і трипараметричної діаграм залежностей досліджуваних ознак. Третій етап досліджень спрямований на поглиблену ідентифікацію клітин з вивченням їх структурних особливостей (інтегральна оптична щільність, зміст ДНК), що відображають певні стани шийки матки при диспластичних, метапластических процесах, внутрішньоепітеліальне і інвазивних формах раку. Отримані результати можуть послужити основою вивчення механізмів перебудови епітеліального пласта в процесі його озлокачествления і визначення природи злоякісної трансформації клітини. Характеризуючи даний напрямок, можна підкреслити значимість цитометричних досліджень і в галузі здійснення контролю якості цитологічної і гістологічної діагностики захворювань шийки матки, а також оцінки ступеня репарації тканини в процесі лікування. Виходячи з фундаментальних досліджень, присвячених оцінці більш ніж 196 якісних і кількісних ознак ядра і клітини і загального фону препарату, визначають, що більш значущі параметри, що характеризують морфологічні особливості ядра (Б.М.Брамберга, І.Я.Зітаре,
Д.П.Плегере, Е.Х.Смілтніекс, 1970). Тому при кількісному аналізі препаратів зазвичай виходять з інформативності розмірних та структурних характеристик ядра: вивчають його площа, периметр, об'єм, діаметр, визначають коефіцієнт форми і оптичну щільність, зміст ДНК, РНК та білка в ньому. На підставі даних проточної цитометрії встановлено, що серед обстежуваних пацієнтів з різною патологією шийки матки в 74,5% випадків є конділоматозних зміни. Ви маєте режим типовою ДНК-гістограми для даної патології шийки матки з високим вмістом
ДНК в G0 / G1-фазі і ранній S-фазі клітинного циклу. Вважають, що спостережувані зміни в ДНК-гистограмме можна розглядати як прояв папіломи-вірусної інфекції в етіології кондиломи шийки матки (KCTsou, DHHong, M.Varello et al, 1984).
Кроветворная система
При цитометричного аналізі клітинних елементів крові використовують критерії, які включають досить широкий спектр параметрів. Це в першу чергу цитометрические маркери з використанням специфічних барвників на РНК, ДНК, різних ферментативних систем (естеразу, фосфатазу). Використовуються також розмірні критерії, які включають обсяг, площа, периметр і діаметр ядра і цитоплазми клітин, а також ядерно-цитоплазматичне відношення.
При дослідженні діагностичного матеріалу при гострих і хронічних формах лейкозів методами цитометрії виявлені деякі відмінності для клітинних елементів тієї чи іншої групи гемобластозів. Використовуючи морфометрические методи оцінки розмірних ознак ядра і цитоплазми бластних клітин, виявлена ??строга кореляція величини клітин і FAB (франко-американо-британської) - класифікації лейкозів. При зіставленні кількісних даних, отриманих при дослідженні клітинних елементів при гострих лимфобластном і мієлобластний лейкоз, що класифікуються за морфологічними ознаками на підгрупи М1 - М6 згідно FAB-класифікації, визначені відмінності між двома варіантами лейкозів, крім підгрупи М2. Реєстровані відмінності в розмірі бластних клітин пов'язані з фазами клітинного циклу. Встановлено, що клітини при гострому мієлобластний лейкоз в S-фазі циклу характеризуються великим розміром ядра. Для цієї ж формі лейкозу, але підгрупи М1 характерна більш мала частка клітин в S-фазі клітинного циклу
(M.Efrench, PABryon, D.Fiere et al, 1981).
Молочна залоза
З метою підвищення діагностичних можливостей цитологічного методу при добро-і злоякісних пухлинах молочної залози, визначення їх гістологічних варіантів, розробки прогностичних критеріїв захворювання - також використовуються дані морфометрії і цитоспектрофотометрії. При об'єктивізації цитологічних препаратів виходячи з інформативності наступних ознак: діаметр, периметр і площа ядра і цитоплазми, ядерно-цитоплазматическое ставлення, текстура хроматину, вміст ДНК і
РНК. На підставі цитометричних досліджень встановлено деякі закономірності, характерні для злоякісних форм пухлин молочної залози. Це варіабельність ядерно-цитоплазматического відносини, наростання розміру ядра і змісту
ДНК. Між двома останніми показниками виявлена ??кореляційна залежність, що характеризується такими особливостями. Показано, що клітини з деякою атипией, яка виражається у збільшенні площі ядра, розподіляються різна по фазах клітинного циклу.
Близько 21% клітин, що знаходяться в області 4с ДНК-гістограми, мають площу ядер понад 125 мкм2. При площі ядер від 50 до 100 мкм2 основна маса клітин знаходиться в G1-фазі циклу і тільки близько 5% клітин припадають на гіпердіплоідную область розподілу ДНК
(CJCornelisse, AJVan Driel-Kulker, F. Meyer, JSPloem, 1985).
Показник ДНК (кількість ДНК в 1 клітці пухлини на кількість ДНК в нормальній клітині) в різних типах злоякісних пухлин молочної залози значно варіює, проте частіше спостерігається тетраплоидия (60 - 80%), доброякісні пухлини, як правило, диплоїдні. Порівняльна оцінка вмісту ДНК в клітинах молочної залози при доброякісних і ракових процесах показала певну залежність між співвідношенням клітин за фазами циклу.
Встановлено, що з прогресуванням процесу кількість диплоїдних клітин в G1-фазі циклу убуває і при III - IV стадії ракового процесу становить 64%. Кількість тетраплоидних клітин наростає в 2 рази і складає близько 17% загальної кількості клітин в порівнянні з проліферативної формою мастопатії і в 3 рази по відношенню до непролиферативной формі мастопатії.

ВИСНОВОК

Таким чином, як проточна, так і статична цитометрия дозволяє досліджувати багато важливих параметрів клітинного циклу.
Найбільш поширеною задачею, розв'язуваної за допомогою даного класу приладів, є ідентифікація і підрахунок клітин, що знаходяться в різних періодах клітинного циклу. Останнім часом паралельно з цими параметрами за допомогою цитометров досліджують також динаміку експресії багатьох важливих клітинних маркерів, що може мати діагностичне і прогностичне значення. Важливо відзначити, що принципових відмінностей між двома типами цитометрії, мабуть, не існує. Тому за допомогою досить простих і недорогих приладів можна відтворювати вельми ефективні методики дослідження клітинного циклу, спочатку розроблені для дорогих проточних цитометров. Такі системи статичної цитометрії включають в себе люмінесцентний мікроскоп, чорно-білу або кольорову телевізійну камеру високої чутливості, пристрій для оцифровки телесигналу і комп'ютер.
Останнім часом в подібних системах все більш широко застосовуються цифрові телекамери, які підключаються до комп'ютера через високопродуктивні порти нового покоління (універсальний послідовний порт). Це дозволяє створювати недорогі і досить потужні системи для статичної цитометрії, які можуть успішно конкурувати як з проточної цитометрії, так з конфокального мікроскопами. В цілому можна зробити висновок про перспективність даного напрямку в цитології, що дає можливість широкого застосування методів кількісної мікроскопії у наукових дослідженнях та клінічній практиці.

ЛІТЕРАТУРА
1. Брамберг Б.М., Зітаре І.Я., Плегере Д.П., Смілтніекс Е.Х.

Термінологічний словник морфологічних ознак клітини

Сторінки: 1 2 3 4