Головна
Реферати » Реферати по біології » Як зібрати мембрану (солюбилизация і реконструкція мембран)

Як зібрати мембрану (солюбилизация і реконструкція мембран)

Як зібрати мембрану (солюбилизация і реконструкція мембран)

Л. І. Барсуков

Московський фізико-технічний інститут, Долгопрудний Московської обл.

Мабуть, сьогодні не потрібно переконувати будь-кого в тому, що дослідження біологічних мембран являють собою один з найважливіших напрямків сучасної біології. Граючи ключову роль в регуляції потоків речовини, енергії та інформації в клітині, мембрани залучені в усі без винятку сторони її життєдіяльності. З цієї причини увагу багатьох вчених в усьому світі вже давно залучено до проблем мембран, і загальне число публікацій на цю тему величезне. Статті, присвячені біологічних мембран або окремим внутрішньоклітинним мембранним системам, широко представлені і в даному журналі (см., Наприклад: МОР. 1996. Комерсант 3, 4, 6; 1997. Комерсант 1, 3, 5-10; 1998. Комерсант 1, 3-6).

Дослідження мембран значною мірою базуються на двох основних методичних прийомах: це розбирання нативної (тобто природного) мембрани на складові її елементи і подальша повна або часткова збірка штучної мембрани з використанням всіх або частини компонентів вихідної мембрани . Стосовно до мембран ці прийоми отримали назву "солюбилизация" і "реконструкція", і саме про них піде далі мова.

Слід сказати, що розбирання досліджуваних об'єктів на складові елементи і їх подальша складання з метою відтворення або всього об'єкта цілком, або окремих його фрагментів, найбільш важливих для підтримки структури і прояви характерних функцій, є улюбленим методом молекулярної біології клітини. Досить згадати успішні експерименти з реконструкції вірусів, рибосом і бактеріальних флагелл з вхідних в їх склад субодиниць, щоб оцінити всю пізнавальну міць та інформативність цього методу дослідження. Ще більшого значення цей підхід має стосовно до біологічних мембран, оскільки вони представляють собою надзвичайно складні багатокомпонентні системи, які виключно гетерогенних за своїм складом та структурної організації.

Перші зусилля з розділення мембран на окремі функціональні одиниці були зроблені в 60-ті роки XX в., І протягом довгого часу цей напрямок розвивався емпірично, за принципом проб і помилок. Були випробувані різні способи впливу на мембрану, включаючи механічну обробку, дія ультразвуку, використання органічних розчинників і різноманітних хімічних агентів. Хоча в ряді випадків за допомогою цих методів були досягнуті певні позитивні результати, однак найчастіше така обробка або була малоефективною, або приводила до деструкції мембранного матеріалу і, що найгірше, до незворотної денатурації мембранних білків. І тільки лише після введення детергентів в практику мембранних досліджень було знайдено той золотий ключик, за допомогою якого вдалося розкрити головні секрети структури і функцій біологічних мембран.

Трохи про детергентах

Перш ніж мембрану зібрати, треба зуміти розібрати її на складові частини. Виявилося, що найлегше це зробити за допомогою детергентів.

Детергенти (від лат. Detergere - мити, очищати) представляють собою поверхнево-активні речовини з миючим дією, яка зумовлена ??їх здатністю утворювати в воді стійкі колоїдні розчини. Поверхнева активність детергентів, тобто здатність адсорбуватися на межі розділу фаз (типу вода-повітря або вода-масло), пов'язана з амфіфільних їх молекул. Амфіфільних (від грец. Філо - люблячий і амфі - обох) називають речовини, в молекулах яких є чітко розмежовані гідрофільні і гідрофобні області, завдяки чому такі молекули володіють спорідненістю не тільки по відношенню до води, але і до неполярних органічних розчинників.

У воді молекули детергентів прагнуть асоціювати один з одним, даючи міцели. Ці агрегати складаються з великого числа детергентних молекул (зазвичай від кількох десятків до кількох сотень), орієнтованих в міцелі таким чином, що їх неполярні групи формують внутрішнє гидрофобное ядро ??міцели, а гідрофільні полярні угруповання перебувають на її поверхні і контактують з оточуючими молекулами води. Саме завдяки наявності гідрофобного ядра міцели здатні солюбілізувати, тобто переводити в розчин неполярні речовини, практично нерозчинні у воді.

В даний час відомо кілька сот різних детергентів. Всі вони поділяються на два основні класи: іонні та неіонні детергенти залежно від наявності або відсутності заряджених груп в гідрофільній області їх молекул. В свою чергу, за типом заряду іонні детергенти діляться на катіонні, що мають позитивний заряд, аніонні, що володіють негативним зарядом, і цвіттер-іонні, у яких є як позитивний, так і негативний заряд, і тому в цілому молекула є електрично нейтральною.

Як параметри, що характеризують здатність детергентів до міцеллообразованія, зазвичай використовують критичну концентрацію міцелоутворення (ККМ) і число агрегації. ККМ - це та концентрація, при якій детергент починає утворювати міцели. До цього він знаходиться у воді в мономерний формі в стані істинного розчину. Число агрегації показує, скільки молекул детергенту припадає на одну міцелу.

В мембранних дослідженнях використовують досить обмежене коло детергентів. В табл. 1 представлені ті з них, які найчастіше застосовуються для солюбілізації та реконструкції мембран. Для цих детергентів характерні досить високі значення ККМ (10-4-10-2 М) і те, що вони відносяться до розряду так званих м'яких детергентів, тобто таких, які не порушують активності мембранних білків і не викликають їх денатурації або роблять це в мінімальному обсязі.

Взагалі кажучи, вибір детергенту для реконструкції мембрани, як правило, представляє складне завдання, оскільки заздалегідь важко передбачити, наскільки вдалим виявиться даний детергент для даної конкретної мембрани і для даного конкретного білка. Крім того, нерідко вимоги до детергентів, використовуваному для солюбилизации мембрани, відрізняються від вимог, що пред'являються до детергентів при реконструкції. Тому іноді доводиться в ході експерименту заміняти один детергент на інший або використати суміші різних детергентів.

Чому і як детергенти руйнують мембрану

Велика частина тих речовин, з яких побудовані біологічні мембрани, а це головним чином білки і ліпіди, практично нерозчинні у воді. Це пов'язано не з тим, що ці речовини є абсолютно гідрофобними. Навпаки, і мембранні ліпіди, і мембранні білки містять у складі своїх молекул досить великі області, утворені гідрофільними угрупованнями, а тому, як і детергенти, є амфіфільних. Весь секрет полягає в балансі гідрофільних і гідрофобних залишків в молекулах цих сполук. А він такий, що величини ККМ для цих речовин дуже малі (10-10-10-9 М), і в воді їх молекули проявляють потужну тенденцію до агрегації. Однак в силу особливостей своєї будови (см. Нижче) вони утворюють у воді не маленькі міцели, а протяжні мембранні агрегати. У цих структурах неполярні ділянки молекул формують гідрофобну область мембрани, яка ізольована від води гідрофільними групами, розташованими на протилежних один одному поверхнях мембранного бішару.

Чому ж детергенти руйнують мембрану? Та тому, що молекули, що утворюють міцели, і молекули, схильні до формування мембран, висувають різні вимоги до геометрії утворюваних ними асоціатів (рис. 2).

Молекули детергентів, що володіють досить об'ємною гідрофільній областю і відносно невеликим гідрофобним ділянкою, в цілому мають форму конуса і тому легко упаковуються в структури з високою кривизною поверхні типу сферичних або циліндричних міцел. У свою чергу, в ліпідних молекулах, що утворять мембрани, відмінності в розмірах гідрофільній і гідрофобною області не настільки великі. В силу цього вони мають форму циліндра (або бруска) і краще всього упаковуються в протяжні ліпідні бішари мінімальної кривизни. Тому при одночасному присутності детергенту і ліпіду у складі одного агрегату виникає конфлікт між прагненням детергенту прийняти міцелярно конфігурацію і тенденцією ліпіду зберегти бислойную упаковку молекул в мембрані.

Поки детергенту в мембрані мало, його присутність виявляється лише у виникненні дефектів упаковки молекул в ліпідному Біслі з утворенням пір, проникних для водорозчинних сполук. Але в міру зростання вмісту детергенту зміни упаковки стають все більш значними і в кінцевому рахунку викликають порушення цілісності мембрани, що призводить до її розривів і навіть до фрагментації на окремі частки. Однак ці частки все ще зберігають мембранну організацію, і вся система в цілому як і раніше може розглядатися як розчин детергенту в мембрані.

Коли ж концентрація детергенту в мембрані досягає деякої критичної величини і подальше збереження бислойной організації молекул стає енергетично невигідним, мембрана починає руйнуватися з утворенням змішаних ліпід-детергентних і білок-детергентних мицелл, які фактично представляють собою розчин компонентів мембрани в надлишку детергенту (рис. 3). Це і є момент солюбилизации, яка призводить до різкого зменшення розміру частинок і як наслідок цього - до зниження каламутності мембранної суспензії та зменшення кількості матеріалу, що осідає, при центрифугировании.

Для солюбилизации краще використовувати детергенти з низькою ККМ, так як такі детергенти легше вбудовуються в мембрану і швидше викликають її розпад до змішаних міцел. У цій якості найбільш ефективні іонні детергенти, але їх недоліком є ??те, що нерідко вони викликають денатурацію білків. Особливо часто це відбувається у випадку катіонних детергентів. Іноді денатурацію можна запобігти додавши ліпід в білковий солюбілізат. Неіонні детергенти менш ефективні як солюбілізірующіх агентів і іноді не повністю відділяють ліпіди від білків. Але, можливо, саме тому в присутності неіонних детергентів білки краще зберігають свою активність.

В солюбілізувати стані мембранні білки можна легко відокремити від основної маси ліпідів і піддати подальшому фракціонування з метою виділення індивідуального білка або групи білків з цікавлять дослідника типом активності. Методи такого фракціонування в даний час добре відпрацьовані і

Сторінки: 1 2