Реферати » Реферати по біології » Як зібрати мембрану (солюбилизация і реконструкція мембран)

Як зібрати мембрану (солюбилизация і реконструкція мембран)

включають спеціальні прийоми розділення білків за допомогою гель-фільтрації, хроматографії та електрофорезу у водному буфері, що містить детергент в концентрації, яка дорівнює або перевищує його ККМ. В деяких випадках солюбілізувати препарати виділених мембранних білків можна використовувати для проведення структурно-функціональних досліджень, але найчастіше для цього необхідні реконструйовані препарати, оскільки багато мембранні білки можуть проявити свою функціональну активність тільки тоді, коли вони знаходяться в повноцінному мембранному оточенні.

Чому і як мембрана збирається

Власне кажучи, збірка мембран відбувається у відповідності з тими ж принципами, що і їх розбирання. Якщо зміст детергенту в змішаних міцелах зменшувати, то прагнення солюбілізірованних в них молекул до мембранного типу упаковки змусить міцели зливатися один з одним і в якийсь момент, коли залишився детергенту стане вже недостатньо для збереження високої кривизни поверхні в укрупнити міцелярних агрегатах, вони перетворюються в мембранні структури.

Таким чином, процеси солюбилизации та реконструкції мембрани дзеркально симетричні в сенсі оборотності перетворень, що відбуваються при зміні змісту детергенту в суміші. Більш того, вони протікають мимоволі, якщо концентрація детергенту стає вище або нижче певної межі. Єдине, що потрібно, щоб запустити процес реконструкції, - це знати, яким чином можна видалити детергент з наявного солюбілізата.

В принципі з цим теж немає великих проблем, оскільки зараз є широкий набір різних способів видалення детергентів. Вибір відповідного способу визначається завданнями реконструкції, а також типом детергенту, який необхідно видалити. Найчастіше використовуються чотири основних способи видалення детергенту: діаліз, гель-фільтрація, сильне розведення солюбілізата і адсорбція детергенту на гідрофобних полимерах.

Найпростіший спосіб - це видалення детергенту за допомогою діалізу через напівпроникну целофанову мембрану. Оскільки молекули детергенту достатньо малі, щоб пройти через пори діалізної мембрани, а концентрація його мономерів у воді, що залежить від ККМ, порівняно висока, то детергент поступово переходить з солюбілізата в діалізу розчин. При цьому його вміст у змішаних міцелах зменшується і, коли воно стає досить низьким, міцели трансформуються в мембранні структури. Цей спосіб хороший для детергентів з високою ККМ, таких, наприклад, як октілглюкозід або холат натрію. Але неіонні детергенти з низькою ККМ типу тритона Х-100 при діалізі видаляються не повністю. Інший недолік цього методу полягає в його тривалості, так як навіть у кращому випадку видалення детергенту може зайняти кілька діб.

Більш швидкий спосіб заснований на видаленні детергенту за допомогою гель-фільтрації, коли солюбілізат пропускають через інертний гель, розмір пор якого достатньо великий, щоб утримати молекули детергенту, але малий у порівнянні з утворюються мембранними частинками, які вільно проходять між гранулами гелю. Незважаючи на швидкість, цей метод не завжди зручний в роботі, особливо коли потрібно провести реконструкцію великої кількості зразків.

Ще швидше, а фактично майже миттєво реконструкцію можна здійснити методом швидкого розбавлення. Для цього солюбілізат розводять великим обсягом не містить детергенту середовища, в результаті чого вміст детергенту в мицеллах різко падає нижче граничного рівня, яким визначається момент початку формування мембрани. Цей метод універсальний і годиться для видалення практично будь-якого детергенту. Проблема лише в тому, що сам зразок при цьому сильно розбавляється, та й детергент видаляється з мембрани далеко не повністю, що може негативно позначитися на якості реконструйованого мембранного препарату.

З максимальною повнотою детергент може бути вилучений з мембрани шляхом його адсорбції на гідрофобних полимерах. Цей спосіб особливо хороший для видалення залишкових кількостей детергенту з вже сформованих мембранних частинок. Однак для видалення детергенту з вихідного солюбілізата він малопридатний, так як на початкових стадіях реконструкції видалення детергенту може супроводжуватися адсорбцією значних кількостей білка і ліпіду на полімері. Тому зазвичай цей метод використовують в комбінації з іншими способами на кінцевій стадії видалення детергенту.

Що можна вважати гарною збіркою

Що ж є реконструйовані мембрани? На рис. 4 наведені електронні мікрофотографії реконструйованих мембран, що містять білок смуги 3, який відповідає за транспорт аніонів в мембрані еритроцитів. Добре видно, що отримані препарати містять частинки овальної форми розміром близько 100 нм, обмежені однією мембраною. На фотографіях, отриманих методом заморожування-сколювання при великому збільшенні, можна бачити, що в мембрану вкраплені ще більш дрібні частинки, які приймають за білки, впроваджені в ліпідний бішар. Як правило, реконструйовані белоксодержащие мембрани являють собою замкнуті бульбашки (або везикули), які отримали назву протеоліпосоми (більш докладно про ліпосомах і везикулах см: Барсуков Л.І. // МОР. 1998. Комерсант 10. С. 2-9).

Звичайно, дуже бажано, щоб реконструйовані мембрани по своїй морфології, структурної організації, фізико-хімічними характеристиками та функціональної активності були б максимально близькі до своїх природних прототипам. Слід, однак, сказати, що наведені на рис. 4 мікрофотографії є ??на рідкість вдалими, і довелося чимало потрудитися, щоб знайти їх у величезному купі публікацій, присвячених реконструкції мембран. Найчастіше результати реконструкції бувають не такі хороші, тому що до цих пір реконструкція є скоріше мистецтвом, ніж наукою. Справа в тому, що немає ні універсального методу реконструкції, ні універсального детергенту, які були б придатні на всі випадки життя. Тому досліднику, стикається з необхідністю отримати реконструйовані мембрани, часто доводиться покладатися на власну інтуїцію та досвід попередників, слідуючи якогось набору емпіричних правил.

З урахуванням сказаного вище не варто дивуватися тому, що, як правило, набагато легше сформулювати критерії ідеальної реконструкції, ніж успішно її здійснити. Очевидно, що така реконструкція повинна призводити до гомогенної популяції моноламеллярних (тобто одношарових) протеоліпосом одного розміру з однаковим співвідношенням ліпід-білок. Бажано, щоб реконструйована мембрана мала таку ж проникність, як і нативна, і щоб протеоліпосоми мали достатній внутрішній водний обсяг, що дозволяє виміряти вміст транспортуються в нього речовин. Мембрана протеоліпосом не повинна містити залишкового детергенту, а її ліпідний склад повинен бути оптимальним для прояву функціональної активності даного білка. Цей перелік можна було б продовжити і далі, якби не ще одна принципово важлива проблема, якої ми поки не стосувалися в нашій статті.

Мова йде про топологічної асиметрії мембран. Справа в тому, що всі нативні мембрани асиметричні в тому сенсі, що їх компоненти (як білки, так і ліпіди) неоднаковим чином розподілені між зовнішньою і внутрішньою сторонами мембрани. В ідеалі реконструйовані мембранні білки повинні мати строго певну орієнтацію в мембрані, відповідну їх орієнтації в нативної мембрані або відповідає завданням поставленого експерименту. У разі ліпідів також бажано мати можливість задавати їм потрібне трансмембранне розподіл. Однак на практиці ці вимоги здійснити вельми складно, так як топологічна орієнтація мембранних компонентів залежить (іноді непередбачуваним чином) від багатьох параметрів, а також від методів, використовуваних для солюбилизации та реконструкції.

Все це показує, що проблема полягає не в тому, щоб провести реконструкцію взагалі (як ми з вами тепер знаємо, вона відбувається мимоволі), а в тому, щоб зробити це правильно чи, кажучи іншими словами , зробити реконструкцію спрямованої на отримання мембран із заданою структурою та функціональними властивостями. Поки ця задача остаточно ще не вирішена, але вже є методичні підходи, що дозволяють змінювати в потрібному напрямку властивості реконструйованих мембран.

Висновок

В даний час багато проблем, пов'язані з реконструкцією мембран, вже вирішені, свідченням чому є колосальна кількість статей, опублікованих на цю тему з початку 60-х років XX в. Не буде перебільшенням сказати, що вражаючі успіхи, досягнуті сьогодні у вивченні мембранних білків, безпосередньо пов'язані з застосуванням методів солюбилизации та реконструкції. За допомогою цих методів багато білки були виділені в індивідуальному стані, що дозволило встановити їх хімічну будову і з'ясувати молекулярні механізми функціонування.

Реконструйовані системи дають прекрасну можливість вивчати принципи, що лежать в основі структурної організації біологічних мембран, і з'ясовувати тонкі деталі міжмолекулярних взаємодій в мембранах за допомогою різних фізико-хімічних методів.

Методами реконструкції вдається відтворювати складні системи, відповідальні за такі життєво важливі функції, як, наприклад, енергетичне забезпечення клітини, транспорт метаболітів, рецепція і передача інформації, а також регуляція внутрішньоклітинних процесів.

І нарешті, знання принципів самосборки молекул в мембранні структури дає нам, з одного боку, можливість зрозуміти, як формуються мембрани всередині клітини, а з іншого - дозволяє застосувати ці принципи для побудови штучних систем, перспективних з точки зору можливостей їх практичного застосування. Саме в цьому напрямку йде сьогодні подальший розвиток досліджень в області реконструкції мембран.

Список літератури

1. Генніс Р. біомембран: Молекулярна структура та функції: Пер. з англ. М .: Мир, 1997.

2. Біологічні мембрани: Методи: Пер. з англ. / За ред. Дж.Б. Фіндлея, Н.Р. Еванза. М .: Мир, 1990. С. 196-250.

3. Овчинников Ю.А. Біоорганічна хімія. М .: Просвещение, 1987. С. 513-636.

4. Кагава Я. біомембранні: Пер. з яп. М .: Вища. шк., 1985.

5. Рекер Е. Біоенергетичні механізми: Нові погляди: Пер. з англ. М .: Мир, 1979.

6. Rigaud J.-L., Pitard В., Levy D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: Application to energy-transducing membrane proteins // Biochim. et biophys. acta. 1995. Vol. 1231. P. 223-246.

7. Lasic D.D. Liposomes: From Physics to Applications. Amsterdam: Elsevier, 1993. P. 243-251.

Сторінки: 1 2