Реферати » Реферати по біології » Атф індуковане зміна внутрішньоклітинної концентрації кальцію в нейронаи неокортексу щурів

Атф індуковане зміна внутрішньоклітинної концентрації кальцію в нейронаи неокортексу щурів

Цей рецептор отримав позначення Р2u. Можливим антагоністом даного рецептора є сурамин. Також було виявлено, що аденін дінуклеотід поліфосфати також присутні у фармакологічній периферії (Hoyle 1990). Hildermann (1991) індентіфіціровать сайт зв'язування для діаденозін тетрафосфат (Ap4A) в мозку щура, який отримав назву діпурінергіческого рецептора, а пізніше Р2d (Pintor et al 1993). Антагоністи даного виду пуринорецепторов поки не виявлені.
Пурінорецептори


Р1 - пурінорецептори

Р2 - пурінорецептори





























A1

A2a
A2b

A3

P2x

P2y

P2t

P2z

P2u

P2d
Таблиця 1 Класична схема субклассіфікаціі пуринів рецепторів.
2.2.5 Перекласифікація пуринорецепторов.
З - за всезростаючих труднощів і неузгодженостей в класичній схемі класифікації? 2 пуринорецепторов і увеличивающемся числі підтипів рецепторів, стало очевидним, що класична схема вимагає перегляду. У 1994 році Abbracchio and Burnstock запропонували нову схему класифікації Р2 - пуринорецепторов. З усіх Р2 - пуринорецепторов вони виокремили три основних сімейства: Р2Х сімейство, пов'язане з іонотропнимі каналами, яке включало чотири підтипи; Р2У - пов'язане з активацією G - білків, що включає сім підтипів і сімейство Р2z - сімейство неселективних пір. Їх гіпотеза грунтувалася в основному на вивченні літературних джерел та аналізі фармакологічного профілю новообнаруженниж агоністів. Надалі теорія підтвердилася клонуванням різних підтипів Р2 - пуринорецепторов. В даний час сімейство Р2Х нараховує шість, а Р2У - сім підкласів. Завдяки інтенсивним дослідженням, практично не залишається сумнівів в тому, що дані сімейства будуть рости і далі (Collo et al 1996).

Р2 - пурінорецептори




P2Z - неселективні пори




Р2Х - сімейство
іонотропних
рецепторів

Р2У - сімейство
метаботропних
рецепторів























Р2Х1
Р2Х2
Р2Х3
Р2Х4
Р2Х5
Р2Х6
Р2У1
Р2У2
Р2У3
Р2У4
Р2У5
Р2У6
Р2У7
Таблиця 2 Сучасна класифікація Р2 типу пуринорецепторов.

3. ОБ'ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
3.1 Підготовка препарату
Дослідження проводились на пірамідальних нейронах моторної області нової кори в тонких зрізах мозку, виділеного з 14 денних щурів. Після декапитации мозок містився в холодний сольовий розчин (0 - 40С). Процедура від початку декапитации до виділення мозку тривала не більше 60-90 секунд. Потім мозок закріплювався поліакриламідних клеєм на підкладці вібротома (Campden, Campden Instruments LTD, UK); камера вібротома заливалася холодним сольовим розчином. Зрізи нарезались сагитального товщиною 250 - 300 мкм; швидкість подачі леза - 1 см / с з частотою 10 Гц. Після приготування зрізи поміщалися в розчин постійно насичується карбогеном (5% СО2 + 95% О2). Перед завантаженням флуоресцентним барвником зрізи инкубировались в постійно оксигенируемом розчині 30 хвилин при температурі 32 градуси. Забарвлення зрізу здійснювалася протягом 30 - 35 хвилин в СО2 насиченому термостаті при температурі 35 градусів. Після фарбування зрізи відмивалися 1 - 1,5 години на постійно оксигенируемом розчині при кімнатній температурі. Всі експерименти проводилися при температурі 32 градуси.
3.2 Характеристики кальцієвого зонда

Для кількісного визначення концентрації кальцію в пірамідальних нейронах моторної області нової кори використовувався барвник Фура-2 AM (рисунок 2) (16).

На малюнку 3 представлений спектр зонда Фура-2 AM. При зв'язуванні з кальцієм відбувається характерне зміна спектра порушення цієї барвника: при порушенні світлом з довжиною хвилі 390 нм відбувається зменшення флуоресценції, а при порушенні світлом, з довжиною хвилі 340 нм - збільшення. Однак, 340 нм є вже ультрафіолетовим світлом, і для її використання необхідний мікроскоп з кварцовими лінзами. Оскільки в нашому випадку був використаний звичайний мікроскоп, то друга хвиля була обрана довжиною 390 нм. 360 нм - це ізобестіческая точка зонда Фура-2, тобто флуоресцентний сигнал при порушенні світлом цієї довжини хвилі не залежить від концентрації Ca2 + і є функція лише концентрації зонда.
Вимірювання флуоресценції при збудженні двома довжинами хвиль дозволяє легко розрахувати [Ca2 +] i в клітці за формулою (24):
[Ca2 +] i = Kd * b * ( R - Rmin) / (Rmax-R)
де Кd - константа дисоціації комплексу Фура-2 з кальцієм, R = F360 / F390 - поточне ставлення флуоресцентних сигналів, Rmin = F360 / F390 | Ca0 - те ж відношення в розчині з низькою концентрацією Ca2 +, Rmax = F360 / F390 | Ca - те ж відношення в розчині з високою концентрацією Ca2 +, b = F390 | Ca0 / F390 | Ca - відношення флуоресцентних сигналів в низької та високої концентрації Ca2 + при збудженні довжиною хвилі 390 нм. Параметри Rmin, Rmax і b визначали експериментально. Для цього були приготовлені базовий розчин (в ммоль / л): KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH = 7.2), Фура-2-0.005; розчин з низькою концентрацією Ca2 + готувався без додавання Ca2 + з добавкою EGTA - 10; розчин з високою концентрацією Ca2 + - з добавкою CaСl2 - 10. Відношення величин флуоресценції визначалося в краплях наведених вище розчинів, поміщених на дно експериментальної камери. В результаті для нашої системи Rmin = 0.33, Rmax = 8.9 і b = 12.8. Параметр Кd був узяв з роботи [Grinkiewicz et al, 1985] і дорівнював 224 нмоль / л.
3.3 Забарвлення зрізів флуоресцентним барвником
Для введення кальцій - чутливого зонда в клітку, зрізи инкубировались в розчині Тіроде, що містить естеріфіцірованний незаряджену форму барвника Фура-2 ацетоксіметілестер в концентрації 5 мкмоль / л, розчинену в диметилсульфоксиді з додаванням детергенту Плуронік F-127 (0.02%). У такій формі барвник проникає в клітину, потім ендогенними естеразами ефірні групи отщепляются, зонд стає зарядженим і покинути клітку не може. Забарвлення проводилася 20 хвилин при температурі 35оС. Концентрація зонда в клітці визначалася шляхом титрування забарвлених клітин розчином барвника, який додавався у позаклітинний розчин. Оцінена таким способом концентрація зонда в клітці була в діапазоні 30 - 70 мкмоль / л.
3.4 Структура експериментальної установки для двох-хвильового виміру концентрації кальцію
Принципова схема установки представлена ??на малюнку 4 Основними елементами її є: джерело світла, система зміни фільтрів, мікроскоп , ФЕУ, модуль попередньої обробки сигналу і комп'ютер.
Джерелом збудливого світла служить ртутна лампа потужністю 50 ватів. Оскільки як кальцій - чутливого зонда використовували індикатор Фура-2 АМ, який є за збудженню двохвильовим (см. Вище), то для кількісного визначення [Ca2 +] i потрібно було одночасно індукувати флуоресценцию обома довжинами хвиль. У нашій конфігурації періодична зміна фільтрів збудження була реалізована за допомогою обертання колеса з вмонтованими в нього двома інтерференційними фільтрами 360 і 390 нм. Частота обертання була 5 Гц. Управління системою зміни фільтрів здійснювалося за допомогою кальцій - вимірювального модуля фірми Luigs und Neumann, Німеччина. Цей же модуль був інтерфейсом попередньої обробки.
Оптична частина установки була змонтована на базі мікроскопа Axioskop, Zeiss. Розділення потоків збудливого світла і флуоресценції вироблялося за допомогою дихроическим дзеркала. Світло, що пройшло через фільтр для порушення флуоресценції, відхилявся дихроическим дзеркалом і за допомогою високоаппертурного иммерсионного об'єктива (40 *, апертура 0.75) фокусувався на об'єкті. Флуоресцентне світло проходив через відповідний інтерференційний фільтр і подавався на фотоелектронний помножувач (ФЕУ). Для зменшення рівня шумів фіксована діафрагма (1 мм) була розташована перед ФЕУ. В результаті флуоресцентний сигнал збирався з фокальній площині діаметром 50 мкм, що дозволило значно поліпшити співвідношення сигнал / шум.
Модуль попередньої обробки дозволяв виробляти компенсацію автофлуоресценціі і, при необхідності, посилювати сигнал, після чого він оцифровується за допомогою цифрового інтерфейсу TIDA і оброблявся комп'ютером за допомогою програм Tida 5.0 і Wintida, розроблених в Гейдельберзі, Німеччина.


Малюнок 4. Принципова схема експериментальної установки для двухволнового виміру кальцію.
3.5 Розчини й зміна розчинів
При роботі зі зрізами все розчини готувалися на основі розчину Тіроде (в ммоль / л): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl2 - 1, CaCl2 - 2.5, NaHCO3 - 26, KH2PO4 - 1.6, глюкоза - 10, постійно аерувати газовою сумішшю 95% О2 + 5% СО2 (pH = 7.4). Бескальциевом розчин готувався еквімолярної заміною CaCl2 на MgCl2 і добавкою 1 ммоль / л EGTA, розчини з підвищеним

Сторінки: 1 2 3 4 5 6