Головна
Реферати » Реферати по біології » Атф індуковане зміна внутрішньоклітинної концентрації кальцію в нейронаи неокортексу щурів

Атф індуковане зміна внутрішньоклітинної концентрації кальцію в нейронаи неокортексу щурів

вмістом калію або кофеїну - заміною NaCl на відповідну кількість KСl або кофеїну.
Зміна розчинів проводилася протокою, швидкість якого можна було варіювати від 10 до 20 мл / хв. Обсяг експериментальної камери становив 0.5 мл. Всі експерименти були проведені при температурі (32 ° С).


4. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Аплікація АТФ в більшості нейронів моторної кори (98 з 102) викликає швидке і короткочасне підвищення концентрації цитозольного кальцію [Ca2 +] i. Концентрація [Ca2 +] i досягає свого максимуму протягом 6-8 секунд і потім відновлюється до базального рівня при триваючому присутності АТФ. Відмивання АТФ призводить до відновлення [Ca2 +] i до рівня спокою. Характерний вид АТФ - індукованого кальцієвого транзиента представлений на малюнку 5


Амплітуда АТФ - індукованого кальцієвого транзиента варіювалася в межах від 50 до 450 нМ. Середнє значення викиду [Ca2 +] i викликаного додатком АТФ в концентрації 100 мкМ знаходилося в межах 200-250 нМ.
Спостерігалась доза - залежність амплітуди відповіді від концентрації АТФ в межах від 10 до 2000 мкМ. На малюнку 7 представлена ??апроксимация експериментальних точок сигма - функцією. Концентрація АТФ, при якій амплітуда відповіді становить половину максимальної, - 220 20 мкМ.

Метою наших досліджень було визначення підтипів пуринорецепторов залучених до генерацію [Ca2 +] i транзиента. Відомо, що АТФ активує кілька типів пуринорецепторов, а саме Р2 пурінорецептори підтипів Р2х і Р2у (Peter Illes et al, 1993, Burnstock and Kennedy 1985), а також Са2 + канали плазмалемми (Кришталь, 1983).
З метою забезпечення достовірності отриманих даних, зважаючи на той факт, що робота проводилась на тонких зрізах мозку, ми провели серію експериментів з придушенням распостранения потенціалів дії за допомогою тетродотоксина (TTX). При використанні TTX з'ясувалося, що амплітуда і форма [Ca2 +] i транзиента не змінюється або змінюється незначно. Отримані результати дозволяють нам припускати, що одержувані нами дані відображають процеси відбуваються в окремій спостережуваної клітці. На жаль ми не мали можливості проводити всі експерименти c тетродотоксином через дорожнечу препарату. Для вивчення характеристик аналізованих пуринорецепторов, приймають участь у генерації [Ca2 +] i транзиента, застосовувалися такі протоколи експериментів.
1.
Додаток АТФ в розчині що не містить Ca2 +. Видалення кальцію з позаклітинного розчину незначно впливало на кальцієвий транзиент, викликаний аплікацією 10 мкМ АТФ, але в теж час пригнічувало на 45% 7% кальцієвий транзиент викликаний 100 мкМ АТФ. (Рис. 8).


1.
Для дослідження здатності внутрішньоклітинного Ca2 + депо до перезаполненію ми послідовно аппліціровалі АТФ кілька разів з інтервалом в 60 секунд у звичайному розчині і в розчині що не містить Ca2 +. Як видно з рисунка 9 друга аплікація АТФ викликала Ca2 + транзиент меншою (на 30%? 4%) амплітуди в порівнянні з першою (контрольної) аплікацією. Наступні аплікації АТФ розділені 60 ти секундним інтервалом не викликали помітного зменшення амплітуди [Ca2 +] i транзинета в порівнянні з другою аплікацією в стандартному розчині


В бескальциевом розчині - навпаки, друга аплікація АТФ викликала значне зменшення Ca2 + транзиента на 40%? 5% від контролю. Наступні аплікації АТФ в бескальциевом розчині приводили до послідовного зменшення амплітуди [Ca2 +] i транзиента і після двох - трьох послідовних аплікацій сигнал зникав взагалі (рисунок 10). Таке зменшення ймовірно обумовлено виснаженням внутрішньоклітинних депо.


1.
Ингибирование захоплення Ca2 + ендоплазматичним Ретикуло тапсигаргина (певним блокатором Ca2 + насоса ЕПР) зменшувало [Ca2 +] i транзіенти, викликані додатком АТФ, на 63%? 5% для концентрації АТФ 100 мкМ АТФ (рис. 11). Як видно з рисунка 11 додаток тапсигаргина не впливало на базальний рівень Ca2 + в клітині.
1.
Додаток кадмію в концентрації 50 мкМ, верапамілу в концентрації 100 мкМ і 50 мкМ нікелю оборотно зменшувало амплітуду [Ca2 +] i транзиента викликаного додатком 100 мкМ АТФ на 35%, 20%, і 15% сответственно. Дані представлені на малюнку 12.

1.
Додаток різних агоністів пуринорецепторов викликало різні за амплітудою відповіді. Порядок відносної активності лігандів для даного об'єкта був наступним ATP? S? ATФ (AДФ ???,? - Methylene ATP? AMФ? УТФ ?? аденозин (ADO), дані преставлен на малюнку 13.


1.
Сурамин, відомий антагоніст Р2 типу пуринорецепторов, зменшував [Ca2 +] i транзіенти, викликані додатком 100 мкМ АТФ на 76%? 7% і також не змінював концентрацію [Ca2 +] i в спокої. Дані представлені на малюнку 14




5. ОБГОВОРЕННЯ
При дослідженні середніх верств неокортексу щурів ми виявили їх здатність відповідати на додаток АТФ. Таким чином ми можемо зробити висновок про наявність в даному об'єкті пуринорецепторов. Відповідь на АТФ є доза - залежним з амплітудою половинного відповіді в 220 нМ. Послідовні додатки АТФ, після другого додатка, не викликали зменшення амплітуди [Ca2 +] in транзиента. З цього можна зробити висновок про відсутність десенситизации даного типу рецепторів.
Досліджуючи джерела підвищення цитозольного кальцію ми виявили, що АТФ активує як іонотропні так і метаботропние рецептори. Блокатори потенціал - керованих кальцієвих каналів такі як кадмій, нікель та верапаміл зменшували АТФ - індуковані кальцієві транзіенти на 35% - 15%, що говорить про опосередкований АТФ активировании потенціал - керованих каналів.
Для дослідження активацію метаботропних рецепторів. Для цього ми докладали АТФ в бескальциевом розчині, - амплітуда відповіді при цьому зменшувалася на 45%? 7%. Цей результат говорить про те, що внутрішньоклітинні депо беруть участь у генерації [Ca2 +] in відповідей, причому їх внесок близький до половини. При повторних аплікаціях АТФ в бескальциевом розчині Ca2 + відповідь зникав повністю після другої аплікації, тобто внутрішньоклітинні депо повністю виснажуються. Досліджуючи шлях вивільнення внутрішньоклітинного кальцію ми аппліціровалі тапсигаргина - спецефічні блокатор АТФ - ази ендоплазматичного ретикулума. [Ca2 +] in транзіенти зменшувалися на 63%? 5% у присутності тапсигаргина. Аплікація коффеіна, агоніста ріанодінового рецепторів, в клітинах моторної кори 14 денних щурів не викликали підвищення рівня [Ca2 +] in. Отже викид [Ca2 +] in з внутрішньоклітинного депо відбувається по IP3 - чутливого механізму.
Надалі ми досліджували більш докладно типи присутніх пуринорецепторов. Побудувавши ряд активності агоністів для Р1 і Р2 пуринорецепторов по амплітудам відповідей, ми зробили висновок базується на відсутності відповіді на аденозин, що в нашому об'єкті присутні тільки Р2 пурінорецептори. Проводячи подальшу субклассіфікацію Р2 типу рецепторів ми використовували сурамин - блокатор деяких типів Р2х і Р2у рецепторів. Додаток Сурамин зменшувало амплітуду [Ca2 +] i транзинета викликаного додатком 100 мкМ АТФ на 76%? 5%, що говорить про наявність цих типів рецепторів в досліджуваному об'єкті.


6. ВИСНОВКИ
1. Додаток АТФ в різних концентраціях викликає Ca2 + транзіенти в клітинах моторної кори щурів.
2. Відповідь на АТФ є доза - залежним з амплітудою половинного відповіді в 220 нМ.
3. АТФ активує як іонотропний так і метаботропние шляхи підвищення внутрішньоклітинного кальцію.
4. В генерації АТФ індукованого підвищення [Ca2 +] in беруть участь деякі типи потенціал - керованих кальцієвих каналів.
5. Вивільнення внутрішньоклітинного кальцію відбувається з IP3 чутливих депо.
6. В даному об'єкті присутсвуют тільки Р2 підтипи пуринорецепторов.
7. Сурамин - антагоніст Р2Х2 і Р2Х5 і Р2У рецепторів зменшує амплітуду [Ca2 +] in транзіенти, що говорить присутності деяких з перерахованих вище рецепторів.


7. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. A.Shmigol, A.Verkhratsky & G. Isenberg (1995): Calcium-induced calcium release in rat sensory neurones. Journal of Physiology (London), 489.3 627-636.
2. A.Shmigol, G. Isenberg, P.Kostyuk & A. Verkhratsky (1994): Calcium-induced Ca2 + release from internal stores in rat dorsal root ganglion neurones. In: European Journal of Neuroscience, Suppl. 7, Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting, p. 146.
3. A.Shmigol, N.Svichar, P.Kostyuk & A.Verkharatsky. (1995): "Incremental" caffeine-induced calcium release in mouse sensory neurones. European Joutnal of Neuroscience, Supple № 8. p111. Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting.
4. A.Shmigol, Yu.Usachev, N.Pronchuk, S.Kirischuk, P.Kostyuk & A.Verkhratsky (1994): Properties of the caffeine sensitive intracellular calcium stores in mammalian neurons. Neurophysiology / Neirophiziologia, v. 26 No. 2, p. 16

Сторінки: 1 2 3 4 5 6