Реферати » Реферати по біології » Трансгенні рослини як біопродуценти білків медичного призначення

Трансгенні рослини як біопродуценти білків медичного призначення

Успіхи в галузі генетичної інженерії рослин відкрили нові можливості для отримання рекомбінантних білків. Для цієї мети широко використовуються клітини бактерій, дріжджів, ссавців і комах. Однак такі системи мають ряд істотних недоліків. У клітинах прокаріотів не відбуваються посттрансля-ционная модифікація і правильне укладання (фолдінг) поліпептидних ланцюгів багатьох еукаріотичних білків. Клітини дріжджів, ссавців і комах позбавлені подібних недоліків, але їх використання в якості біопродуцентов обмежене високою собівартістю виходу рекомбінантних білків (Russel, Clarke, 1999).

Порівняно з вищезазначеними системами експресії рослини мають ряд особливостей і переваж-вин. Перш за все необхідно зазначити, що в клітинах вищих рослин відбуваються гликозилирование і фолдінг білків, подібні з таким в клітинах ссавців. Культивування рослин не вимагає доро-гостоящего обладнання, а сільськогосподарські масштаби продукції гарантують доступність реком-бінантного препарату в кількостях, достатніх для клінічних випробувань і широкого терапевтичного використання. На відміну від тварин, рослинні клітини не містять в своєму складі патогенні для людини віруси, а також пріони і, таким чином, можуть служити безпечним джерелом рекомбінантних білків медичного призначення. Хоча вартість виділення і очищення цільового білка з рослин-продуцентів може бути порівнянна з такою для інших систем, напрацювання сирого матеріалу обходиться значно дешевше. У ряді випадків, наприклад, при використанні трансгенних рослин в якості "їстівних вакцин" виділення білка в чистому вигляді не потрібно. На додаток до всього перенос фраг-ментів екзогенної ДНК в рослинний геном і регенерація у рослин відбуваються значно простіше в порівнянні з тваринами (Daniell et al., 2001).

Відомо, що апарат транскрипції і трансляції у рослин є універсальним і може бути адап-тирован не тільки для накопичення гомологічних білків, що не синтезуються даним видом рослини, а й для синтезу гетерологічних білків як бактеріального, так і тваринного походження. З іншого боку, самі рослини in vivo можуть служити сприятливим середовищем для розвитку різних організмів - бактерій і вірусів, геном яких може бути модифікований і адаптований для синтезу відповідних гетерологіч-них білків. Аналізуючи дані літератури, необхідно відзначити, що пошук різних систем для експресії чужорідних генів за останні десять років було пов'язане з розвитком трьох основних підходів.

Першим з них був запропонований шлях використання трансгенних рослин, в ядерний геном яких Перене-сени гени, контролюючі синтез відповідних гетерологічних білків (De la Riva, 1998). Отримання таких рослин було засновано на природній здатності грунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens переносити частину своєї власної ДНК у вигляді Т-області мегаплазміди в рослинні клітини. Саме ця частина Ti-плазміди була використана вченими для переносу генно-інженерних конструкцій, що включають різні цільові гени. В якості цільових можна було використовувати і гени гетерологічних білків міді-цинского призначення. Необхідно відзначити, що використання тільки агробактеріальної переносу в значи-котельної мірою звужувало коло рослин-реципієнтів і обмежувало його, як правило, до дводольних. Тому подальший розвиток ідеї використання рослинного генома для синтезу гетерологічних білків стимули-рова пошук нових способів переносу фрагментів екзогенної ДНК в геном рослин. Були розроблені мето-ди прямої доставки чужорідних генів в рослинний геном, такі, як мікроін'єкції (Neuhaus et al., 1987), електропорація (Fromm et al., 1985) і методи біобаллістікі (Klein et al., 1987). У цьому слу-чаї для переносу використовувалася очищена плазмідна ДНК, в якій містилися генетичні конструк-ції з цільовими генами.

При перенесенні в геном рослини чужорідні гени, як правило, стабільно інтегруються і передаються по-Томка в наступних поколіннях згідно законам Менделя (Horsch et al., 1984; Budar et al., 1986; De-roles, Gardner, 1988; Heberle-Bors et al., 1988).

Хоча ідея впровадження екзогенної ДНК в рослинний геном для напрацювання відповідних продуктів в рослині представляється досить перспективною, цей підхід не позбавлений і деяких недоліків. Серед них не-обходимо відзначити низький рівень експресії перенесених генів, навіть при використанні дуже сильних промоторів. Зміст сироватковогоальбуміну людини в трансгенних тканинах тютюну склало 0,02% від сумарного білка (Sijmons et al., 1990). Ще менші значення були отримані для еритропоетину (0,003%) і b-інтерферону (0,001%) (Edelbaum, 1992; Kusnadi et al., 1997). Однією з причин цього, мабуть, є збільшення швидкості деградації мРНК чужеродно-го гена, коли її рівень досягає порогового значення. Цей механізм, можливо, служить одним із способів захисту рослини від РНК-вірусів (Matzke et al., 1994; Matzke M., Matzke A., 1995; Vaucheret, 2001). Другою причиною низького рівня продукції є протеоліз чужорідних білків в цитоплазмі рости-котельної клітини. Введення в поліпептидних ланцюг цільового білка сигнальних послідовностей, направляю-щих його накопичення в ендоплазматичної мережі або секрецію в апопласт, де частота протеолізу значно нижче, дозволяє досягти підвищення продуктивності трансгенних рослин в 100 раз (Giddings et al., 2000; Menassa et al., 2001). Експресія цільових білків в запасний тканини насіння, де рівень біодеградації нижче, ніж в обводнених тканинах (листя, плоди), сприяє підвищенню продуктивності на 2-3 порядки. Так, містить жаніе химерного енкефаліну людини в насінні трансгенного A. thaliana склало 2,9% від сумарного білка. Цього вдалося досягти введенням в поліпептидних ланцюг енкефаліну сигнальної послідовності глю-Теліна (запасного білка рису), направляючої його транспортування в компартменти накопичення запасних білків. Химерний ген перебував під контролем промотора гена глютеліну, який направляв його тканеспеціфічную транскрипцію в клітинах запасний тканини насіння (Vandekerckhove et al., 1989).

Інтеграція чужорідних генів в ядерний геном рослини пов'язана і з низкою проблем біобезпеки використання генетично модифікованих організмів. При отриманні трансгенних рослин в сель-скохозяйственних масштабах існує небезпека витоку трансгени у навколишнє середовище (вихід з-під контролю) у результаті перезапилення з близькородинними дикорослими видами. Для підвищення рів-ня біобезпеки поруч дослідників було запропоновано використовувати для трансгенезу стерильні по чоловічій лінії рослини (Menassa et al., 2001).

Іншою проблемою, що виникає при інтеграції гетерологічних генів в ядерний геном рослин, є-ється ймовірність "замолканія" трансгенів в наступних поколіннях (сайленсінг). Ймовірність сайлен-Сінга різко зростає при вбудовуванні безлічі копій чужорідного гена на геном рослини (Finnegan, McElroy, 1994; Matzke et al., 1994; Matzke М., Matzke А., 1995). Тому при створенні трансгенних рослин-біопродуцентов рекомбінантних білків серед трансформантов відбирають рослини, що містять тільки одну встройку чужорідного гена.

У зв'язку з перерахованими вище проблемами, що виникають при інтеграції трансгенів в ядерний ге-ном, вельми привабливим представляється спосіб перенесення екзогенної ДНК в геном хлоропластів. Хлоропласти - органели рослинної клітини, які містять зелений пігмент хлорофіл, а також ряд дру-гих пігментів, які беруть участь у поглинанні світлової енергії та здійсненні фотохімічних реак-цій. За формою і розмірами хлоропласти вищих рослин досить однорідні. Деяка варіабельність спостерігається у ставленні їх числа в розрахунку на одну клітку, яке варіює від декількох десятків до сот-ні і більше. Кожен окремий хлоропласт оточений подвійною мембраною і має складну внутрішню структу-ру. В одній рослинній клітині в середньому міститься від 5 до 10 тис. Копій хлоропластной ДНК, за рахунок чого рівень експресії чужорідних білків досягає значень, порівнянних з рівнем експресії в E. coli (до 40% від сумарного білка клітини) (Staub et al., 2000; De Cosa et al., 2001). Однак в літературі зустрічаються тільки поодинокі роботи по отриманню рослин з генетично модифікованими хлоропла-стами. Це пов'язано з надзвичайною складністю методів їх трансформації і подальшого відбору.

Третій шлях використання рослин для накопичення білків гетерологічного походження заснований на природній здатності рослинних вірусів проникати в клітини рослин і колонізувати рослинні тка-ні (Mushegian, Shepherd, 1995). На цій основі виникає реальна можливість модифікації вірусного гено-ма та адаптації його не тільки в якості вектора для доставки в рослини відповідних генетичних конст-рукцій, але і в якості матриць для транзієнтної експресії генів, що кодують синтез білків, що представляють комерційний інтерес. Для зараження рослинних тканин використовуються рекомбінантні (+) РНК-віруси рослин, несучі в складі свого геному транскрипт чужорідного гена (Mushegian, Shepherd, 1995). Швидкість мультиплікації вірусної РНК в рослинах надзвичайно висока, за рахунок чого досягається висока ко-пійность транскриптов чужорідних генів в цитоплазмі заражених клітин. Тому продуктивність вірусної системи експресії в середньому на 2 порядки вище в порівнянні зі стабільною трансформацією рослин (Giddings et al., 2000).

В даний час широко використовуються два види вірусів для продукції чужорідних білків в рослинах: ві-рус тютюнової мозаїки (ВТМ) та вірус мозаїки коров'ячого гороху (ВМКГ). Вектор на основі РНК ВТМ використовувався для отримання інгібітору реплікації ВІЛ ?-тріхосантіна в Nicotiana benthamiana (Kumagai et al., 1993). Для цього цільову послідовність, що кодує ?-тріхосантін, помістили під субгеномний промотор білка оболонки ВТМ. Через два тижні після зараження рекомбінантний ?-тріхосантін накопичувався в листках N. Benthamianaв кількості 2% від сумарного білка. На основі ВМКГ вдалося отримати химерні частинки цього вірусу з експонованими на поверхні антигенними детермінантами ВИЧ1 (gp41) (Porta et al., 1996). Для цього послідовність епітопу gp41 була "зшита" з геном білка оболонки ВМКГ. Такі частинки володіли високою іммунногенность і були здатні нейтралізувати інфекційні властивості ВИЧ1 in vivo.

Порівнюючи шляху напрацювання гетерологичних білків в рослинних тканинах, необхідно відзначити, що кожен з них має свої переваги і недоліки. В трансгенних рослинах перенесені гени стабільно вбудовуються в геном і зберігаються в наступних поколіннях,

Сторінки: 1 2 3 4

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар