Реферати » Реферати з біології » Генна інженерія

Генна інженерія

розмноження в бактерії. Замість нього можна ввести чужорідну ДНК, яка буде розмножуватися разом з фагової, після інфікування бактерій.

Домогтися реплікації і ампліфікації у складі плазмідної (або фагової)
ДНК після трансформації бактеріальної клітини ще не означає вирішити всі її проблеми. Насамперед виникають два питання:

1. Як розпізнавати клони, що містять гібридну ДНК, серед потомства трансформованих клітин або живих бактеріофагів?

1. Як ідентифікувати необхідні фрагменти ДНК серед багатьох клонованих невідомих фрагментів?

Наприклад можна відбирати бактеріальні клітини, якщо вони несуть плазміду з фактором стійкості до антибіотика, вирощуючи їх на середовищі, на середовищі, що містить антибіотик. Нетрансформовані клітини без плазмід (і, отже, без гена стійкості до антибіотика) просто не будуть рости на такому середовищі. Останнім часом розроблено багато спеціальних методів вакцинації, які дозволяють відбирати лише рекомбінантні клітини.

Для генної інженерії білків недостатньо відібрати і розмножити певні фрагменти ДНК, необхідно ще індукувати їх експресію в клітині. Для цього необхідно «підключити» рекомбинантную молекулу ДНК, подальшу трансляцію матричної РНК і процесинг як на транскрипционном, так і на трансляційних рівнях.

1.4. ІДЕНТИФІКАЦІЯ І АНАЛІЗ ГЕНІВ.

Ще одна область застосування рестриктаз - ідентифікація і визначення числа генів. Ці завдання вирішуються за допомогою методу розробленого Саузерну.

Тотальну ДНК з клітин людини гидролизуют ендонуклеазою приблизно на
500 000 фрагментів довжиною від 102 до 105 нуклеотидних пар. Потім фрагменти поділяють за молекулярною масою за допомогою гель-електрофорезу в ага троянді, після чого ДНК денатурує з лугом прямо в гелі, щоб отримати одноцепочной фрагменти. Їх переносять на нітроцелюлозні фільтр і фіксують висушуванням при 800С. У результаті виходить відбиток (репліка) картини поділу фрагментів ДНК за їх розміром. Ці фрагменти можна ідентифікувати методом гібридизації з радіоактивними ДНК-зондами, специфічними для певних генів або хромосом. Будь-який фрагмент, що містить всю послідовність зондіруемой гена або його частина, буде виглядати на Радіоавтографія у вигляді темної смуги.

Зонди і генні бібліотеки. Головна умова такого аналізу - наявність відповідного геноспеціфіческого радіоактивного ДНК-зонда, який можна використовувати для гібридизації.

1.5. ГІБРИДИЗАЦІЯ нуклеїнових кислот.

Здатність до гібридизації ланцюгів ДНК лежить в основі багатьох методичних прийомів молекулярної біології, тому більш докладний опис принципу гібридизації буде корисним. Більшість природних ДНК зустрічається у вигляді двухцепочная молекул. Їх стійкість підтримується завдяки тому, що пиримидиновое підставу цитозин (C) злучається з пуріновим підставою гуаніном (G), в той час як пиримидиновое підставу тимін (T) злучається з пуріновим підставою аденіном (A). Ці компліментарні пари основ утримуються водневими зв'язками (трьома в парі GC і двома в парі AT), які відносно легко розриваються, при цьому одноцепочной фрагменти
ДНК, присутні в розчині, знову формують подвійну спіраль. Для реассоціаціі не має значення походження одноцепочной ДНК, не потрібно навіть повної компліментарності окремих ланцюгів. Реассоціаціі відбувається навіть тоді, коли якась частина підстав у кожній ланцюзі не комплиментарна.
Одноцепочной ДНК може злучатися, тобто гібридизувати навіть з РНК, якщо у них є компліментарні підстави.

"ПРОГУЛЯНКА хромосоми". Метод гібридизації корисно використовувати, наприклад, для аналізу дуже протяжного гена. При цьому за допомогою відповідного зонда з геномної бібліотеки ДНК спочатку витягується якась частина такого гена. Нуклеотидних послідовність цієї частини гена буде, як правило, длинее зонда, і її кінці будуть перекриватися з іншими фрагментами даного гена в цій бібліотеці, тобто будуть, принаймні, частково гібридизувати з ними. Вільні кінці цих фрагментів будуть гібридизувати з наступними і так далі, поки весь структурний ген не буде повністю ідентифікований серією перекриваються фрагментів. Саме таким чином було реконструйовано структурний ген фактора згортання крові VII людини, незвично довгий, що складається з 180 000 пар нуклеотидів.

Існуючий метод гібридизації in situ, цей метод уже вдосконалений на стільки, що з його допомогою можна локалізувати в хромосомах навіть унікальні гени, такі як ген інсуліну. Ось приклад деяких генів людини, ідентифікованих за допомогою гібридизації (таблиця
1).

ТАБЛИЦЯ 1.

Деякі гени людини, ідентифіковані за допомогою гібридизації.

| Ген, довжина послідовності ДНК і число копій. | Локалізація. |
| Інеулін (900 п.н.) | 11? 15 |
| Інтерферон | 9? |
| | 2,1 - pter |
| Онтоген fes (4000 п.н.) | 15 q 2,4 |
| | - gter |
| Сироватковий альбулін (1600 п.н.) | 4 q 11 |
| | - 22 |
| Міозин МНС (2200 п.н.) | 17? 1,2 |
| | - pter |
| колаген (COL 1A2 ) | 7 q 22 |

1.6. СОРТИРОВКА ХРОМОСОМ.

Наступний метод - це метод сортування хромосом при опмощі цітофлюрометріі. Цей метод може бути використаний у двох різних цілях:

1) Для ідентифікації та кількісного аналізу великої кількості хромосом протягом дуже короткого часу.

2) для препаративного поділу хромосом. Цей метод має дві переваги перед стандартними методами аналізу хромосом: по-перше, він повністю автоматичний, завдяки чому виключається елемент суб'єктивності по-друге, він набагато швидше (рис.3)

Однак важливіше, що цей метод дозволяє препаративно розділяти хромосоми, і за наявності специфічних зондів досліджувати структуру і функцію окремих генів стає відносно просто. У цьому випадку ген можна локалізувати в хромосомі за допомогою гібридизації in situ, розмножити його ДНК шляхом клонування і секвенування.

Рис. 3. Принцип сортування хромосом за допомогою лазера. Хромосоми пофарбовані флуоресціюючим барвником. Флуоресценція збуджується лазерним променем і вимірюється для кожної хромосоми окремо. Дані вимірювань використовують для сортування хромосом.

1.7. Секвенування ДНК.

Послідовність нуклеотидів і генетичний код.

Методи певній послідовності амінокислот у поліпептидному ланцюзі були відомі ще в 50-х роках. Теоретично це відносно легка проблема, оскільки всі 20 амінокислот, що зустрічаються в природних білках, мають різні властивості. З іншого боку, нуклеотидних послідовність
ДНК щодо однорідна за складом однорідних ланок, бо містить лише чотири типи азотистих основ - гуанін, цитозин, аденін і тимін.
Коли в 60-ті роки було розшифровано генетичний код, з'явилася можливість встановлювати (дедуціровать) нуклеотидну послідовність відповідного білка. Однак генетичний код є виродженим, тобто однієї і тієї ж амінокислоті відповідають кілька нуклеотидних триплетів. Отже відомості про нуклеотидної послідовності амінокислот у білку, не однозначні. Крім того послідовності амінокислот не містять жодної інформації про послідовність некодуючих ділянок ДНК. Принцип полягає в наступному: довгу молекулу
ДНК фрагментують за допомогою агентів, що розщеплюються в специфічних сайтах. Потім визначають послідовність нуклеотидів в кожному з цих фрагментів. Черговість фрагментів в цілій молекулі відновлюють, використовуючи що перекривають кінці: ідентичні ланцюга розрізають повторно другий рестриктазою, а потім послідовності, що перекриваються утворюються при обробці двома рестриктазами різної специфічності, порівнюють. Так може бути реконструйована повна послідовність. У межах окремих фрагментів порядок нуклеотидів визначають за допомогою спеціальних методів.
Раніше секвенування ДНК було вельми важкою справою, тепер же воно здійснюється дуже легко і швидко. Для цього необхідно довгу молекулу
ДНК за допомогою рестріктази розділити на фрагменти зручного розміру, а потім, якщо потрібно, міццю спеціальних методів. Раніше секвенування ДНК було вельми важкою справою, тепер же воно здійснюється дуже легко і швидко. Для цього необхідно довгу молекулу ДНК за допомогою рестріктази розділити на фрагменти зручного розміру, а потім, якщо потрібно, ні відомості і про нетранскрібірусних ділянках ДНК, важливих для контролю транскрипції (так звані оператори та промотори).

1.8.ДІНАМІЧНОСТЬ ГЕНОМУ.

Методи нової гентікі розширили наші знання про структуру генетичного матеріалу. У 1963 році Тейлор описав "індуковані фагом мутації E.
Coli", вкоре після цього, Старлінгер і Седлер описали IS-елементів у бактерій. Ці елементи отримали назву мобільних, тепер же вони визначаються як специфічні послідовності ДНК, які можуть неодноразово впроваджуватися в різні сайти геному. Перенесення генів від однієї бактерії до іншої за допомогою фага (трансдукція) відомий давно, а тепер використовується і в генетичній інженерії еукаріот (включаючи клітини ссавців). Можливо, такі процеси можуть відбуватися і в природі.
Більше того, послідовності ДНК, гомологічні глобінових гену людини, були виявлені у бобових рослин. Функція такого гена у рослин може полягати в тому, щоб "забезпечити киснем бульбочкові бактерії в тканини". Наявність цього гена може бути пояснено перенесенням його від комах або ссавців. (Рис. 4).

Стор 142 рис 2.95

намалюємо САМІ

Отже, з вище викладеного можна зробити наступний висновок, що теоретичними передумовами формування генної інженерії як науки, з'явилися:

1. Відкриття подвійної спіралі ДНК.

1. Отримання інформації про матричний синтезі:
3. Реплікації ДНК.
4. Транскрипции ДНК.
5. Трансляції ДНК.

3. Відкриття плазмід.

4. Відкриття фрагментів рестриктаз.

5. Здійснення процесу рекомбінації хромосом

6. Ідентифікація та аналіз генів.

6. Здатність до гібридизації ланцюгів ДНК.

6. Секвенирование ДНК.

ГЛАВА 2. МОЖЛИВОСТІ генної інженерії.

Значний прогрес досягнуто в практичній області створення нових продуктів для медичної промисловості і лікування хвороб людини
(табл.2).

ТАБЛИЦЯ 2.

Використання генно-інженерних продуктів в медицині.
| Продукт | Природні продукти і сфера застосування |
| | генно-інженерних продуктів |
| Антікоагулятори | Активатор тканинного плазміногену ( АТП), активує |
| | плазмін. Фермент, залучений в розсмоктування |
| | тромбів; ефективний при лікуванні хворих на інфаркт |
| | міокарда. |
| Фактори крові | Фактор VIII прискорює утворення згустків; дефіцитний |
| | у гемофіліків. Використання фактора VIII, |
| | отриманого генно-інженерними методами,

Сторінки: 1 2 3 4

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар