Головна
Реферати » Реферати по біології » Світіння супроводжує біологічні реакції

Світіння супроводжує біологічні реакції

не подоланий перешкодою на шляху до широкого використання власної хемилюминесценции в аналітичних цілях.

Значного поширення набуло проте вимір хемілюмінесценції в присутності певних сполук, які отримали у вітчизняній літературі загальну назву "активаторів", а за кордоном - "підсилювачів"
(enhancer) хемилюминесценции . По механізму дії активатори розпадаються на дві чітко розрізняються групи, які можна відповідно назвати хімічними і фізичними активаторами.

Хімічні активатори ХЛ - це сполуки, що вступають в реакції з активними формами кисню або органічними вільними радикалами, в ході яких утворюються молекули продуктів в збудженому електронному стані.

Спостережуване при цьому hemilum пов'язано з переходом молекул в основний стан., Що призводить до висвічення фотонів:

Активатор + радикали> продукт *> продукт + фотон

Добре відомими представниками таких активаторів можуть служити люмінол (3-амінофталевий гідразид, див. Рис. 4) і люцигенина [Біс (N-метілакрідіній)] Фізичні активатори не вступають в хімічні реакції і не впливають на хід реакцій, супроводжуються hemilumм, але проте багаторазово посилюють інтенсивність хемілюмінесценції. В основі їх дії лежить фізичний процес процесу переносу (міграції) енергії з молекули продукту хемілюмінесцентний реакції на активатор:

Радикали> продукт *> продукт + фотон 1 (Неактивована ХЛ)
Продукт * + активатор> продукт + активатор *> фотон 2 (активована ХЛ)

Хемілюмінесцентний імунний аналіз

За ідеології хемілюмінесцентний імунний аналіз не відрізняється від радіоімунної, з тією тільки різницею, що замість радіоактивно-мічених субстратів або антитіл використовуються субстрати і антитіла, "мічені" з'єднанням, яке вступає в реакції, що супроводжуються хемілюмінесценції, в присутності перекису водню і каталізатора (зазвичай це фермент пероксидаза).

Хемілюмінесцентний міткою (ХЛ-міткою) найчастіше служать низькомолекулярні сполуки, за хімічною структурою близькі люмінолу і люцигенина, такі як ізолюмінол, сукцінілірованний люмінол, ефіри акридин та інші. Приєднання хемілюмінесцентний мітки проводиться або до антигену, т. Е. Низькомолекулярних сполук або до антитіла на цей антиген. У першому випадку метод називається CIA (Chemiluminescent Immuno
Assay), у другому - ICMA (ImmunoChemiluminoMetric Assay). По русски це відповідало б Хиа (Хемілюмінесцентний Імунний Аналіз) і ІХМА (иммуно-
ХемілюміноМетріческій Аналіз).

Обидва методи спрямовані на визначення біологічно-важливих низькомолекулярних сполук (наприклад, гормонів) в тих концентраціях (як правило, дуже низьких), в яких вони зустрічаються в біологічних об'єктах.

При використанні методу CIA до розчину, що містить цікавить нас аналізоване з'єднання (позначимо його як A) додають певну кількість того-ж, але ХЛ-меченного з'єднання (позначимо його як A *) і антитіла (анти-A). Утворюється суміш мічених і немічених імунних комплексів (A-анти-A і A *-анти-A, відповідно):

A + A * + анти-A> A-анти-A + A *-анти-A.

Дуже важливо, що пропорція між міченим і немічених імунними комплексами залежить від того, скільки меченного антигену ми додали (A *) і скільки немічених було в досліджуваній пробі (A), а саме: чим більше було немічених антигену, тим менше частка мічених антитіл.

Тепер залишається очистити суміш імунних комплексів і визначити кількість A *-анти-A по хемилюминесценции. Інтенсивність ХЛ буде тим менше, чим більше було немічених антигену A (т. Е. Аналізованого речовини) в досліджуваній пробі. Щоб аналіз був кількісним, попередньо будують калібрувальну криву, т. Е. Вимірюють залежність інтенсивності ХЛ в кінцевої пробі від концентрації стандартного розчину досліджуваного речовини A. Потім вимірюють інтенсивність ХЛ в розчині з невідомої концентрацією антигену (A), повторюючи ті ж процедури, і по калібрувальної кривої знаходять концентрацію A.

При використанні методу ICMA беруть надлишок ХЛ-меченного антитіла (анти-
A *) і додають до нього розчин з досліджуваним речовиною (A ). Утворюється ХЛ-мічений імунний комплекс:

A + анти-A *> A-анти-A *

Залишається відокремити імунні комплекси від інших учасників реакції і виміряти інтенсивність ХЛ . В даному випадку вона буде тим вище, чим більше було аналізованого речовини A в пробі. Для кількісного аналізу й тут попередньо будують калібрувальну криву.

В обох методах одна з практичних труднощів - це очистка імунних комплексів. Вона вирішується також методами імунохімії. Деталі цієї техніки ми тут розглядати не будемо, але один з підходів полягає, наприклад, у використанні порошку сорбенту (див. Рис. 6 В), до поверхні якого
"пришиті" (т. Е. приєднані ковалентного хімічним зв'язком) антитіла до анти-А (назвемо їх анти-анти-А). У присутності розчинених комплексів (А- анти-А та / або А *-анти-А) утворюється потрійний комплекс ("сандвіч"): (анти-анти
А) - (анти-А )-А та / або (анти-анти-А) - (анти-А)-А *. Адсорбент можна осадити і потім визначити в осаді (після додаткових обробок) кількість меченного антигену.

Біолюмінесценція

Біолюмінесценція - (БЛ) - це hemilum живих організмів, видиме простим оком. Здатністю до БЛ володіють організми, що належать до самих різних систематичних груп: бактеріям, грибам, молюскам, комахою. Механізм реакцій, що супроводжуються hemilumм, досить різний у різних видів; проте зазвичай включає в себе хімічне перетворення певного низкомолекулярного субстрату, званого люциферином, каталізуються ферментом, званим люціферази.

З розвитком техніки виміру дуже слабких світлових потоків стало ясно, що світіння при хімічних реакціях (хемилюминесценция) - не така вже екзотика. Слабке світіння супроводжує по суті всі хімічні реакції, що йдуть за участю вільних радикалів. Власне свічення тварин клітин і тканин обумовлено переважно реакціями ланцюгового окислення ліпідів і реакціями, що супроводжують взаємодію окису азоту та супероксидного радикала.

Відоме з давніх часів видиме простим оком світіння деяких організмів, наприклад світляка, яке називають біолюмінесценція, також знайшло широке застосування в клінічних аналізах і медико-біологічних наукових дослідженнях.

Біолюмінесценція світляка

Усім відоме hemilum світлячків відбувається в результаті біохімічної реакції окислення светлячкового люциферина киснем повітря в присутності аденозинтрифосфорної кислоти (ATP):
| E + LH2 + ATP> E-LH2-AMP + PP |
| E-LH2-AMP P *-E-AMP> E + P + AMP + фотон |

Тут AMP - аденозинмонофосфат, PP - пірофосфат, E - люціферази, LH2 - люциферин, P * і P - продукт реакції (оксілюціферін) в збудженому і основному станах, відповідно.

В відсутність АТФ біолюмінесценція не спостерігається; на цьому заснований один з найбільш чутливих методів аналізу АТФ в різних об'єктах. Для визначення вмісту АТФ дивляться хемілюмінесценцію в досліджуваному розчині, до якого додають суміш люциферина і люціферази, виділених з світлячків або отриманих синтетично і методом генної інженерії.

Вдається визначати зміст АТФ в зразку від 10-17 моля і вище.

Оскільки біосинтез АТФ - показник нормальної життєдіяльності клітин, препарат люциферин - люціферази світляка використовують для виявлення бактеріального зараження в якому-небудь середовищі, оцінки життєздатності еритроцитів при консервуванні крові, вивчення дії на мікроорганізми антибіотиків і т Останнім час використовують препарати иммобилизованной люціферази (т. е. ферменту, молекули якого хімічно пов'язані з полімерною плівкою), стабільність якої вище; такий препарат можна використовувати багато разів.

Біолюмінесценція світних бактерій

До числа світних відноситься трохи видів бактерій. Хемілюмінесцентна реакція, безпосередньо супроводжувана hemilumм, каталізується ферментом
- бактеріальної люціферази і включає в себе процеси окислення відновленого флавінмононуклеотиду ФМН-Н2 до ФМН і одночасно - алифатического (С14) альдегіду до миристиновой (С14) кислоти В останні роки набувають все більшого поширення біохімічні аналізи, в яких як тест-об'єкта використовують цілі бактеріальні клітини (в суспензії), екстракти світних бактерій, ізольований фермент - люціферази.

Перш за все, вимір біолюмінесценції бактерій можна використовувати для визначення низьких концентрацій кисню. Справа в тому, що за відсутності кисню фотобактеріі не володіють hemilumм, hemilum посилюється пропорційно концентрації кисню в середовищі в інтервалі концентрацій О2 від 2 - 10-8 до 5 - 10-6 моль / л.

Можна використовувати світні бактерії і в якості "лабораторного тваринного", т. Е. Живих організмів, на яких вивчають, наприклад, дію різних токсичних речовин. Світні бактерії досить чутливі до домішкам токсичних речовин у воді, і вимір біолюмінесценції можна використовувати для оцінки забруднення води токсичними сполуками, скажімо іонами важких металів.

З іншого боку, hemilum бактерій можна використовувати для попередньої оцінки ефективності нових антибіотиків. Але найбільш перспективно, безсумнівно, застосування очищених препаратів бактеріальної люціферази. Фермент, очищений від домішок низькомолекулярних сполук, має здатність до випромінювання світла лише в присутності всіх трьох субстратів: кисню, ФМН-Н2 і довголанцюжкових альдегіду (з довжиною ланцюга не менше 8 вуглецевих атомів). Додавши до ізольованої бактеріальної люціферази ФМН-Н2, дослідник отримує високочутливу систему для визначення аліфатичних альдегідів; до їх числа належать, зокрема, статеві гормони комах, феромони, які виявляються в кількості 10
14 моль, що дозволяє вивчати метаболізм цих речовин у однієї особини.

Біолюмінесценція медузи Aequorea

Останнім часом для виявлення малих кількостей іонів кальцію широко використовується хемилюминесценция білка, виділеного з медузи Aequorea. Цей фотопротеін, званий акворіном, містить в собі ковалентно пов'язаний люциферин, який у присутності іонів Са2 + піддається хімічним перетворенням з утворенням продукту в збудженому електронному стані.
Внаслідок малої інерційності і високої чутливості БІОЛЮМІНЕСЦЕНТНІ метод досить ефективний при вивченні вивільнення і зв'язування Са2 + в біологічних системах, наприклад, під час м'язового скорочення. При цьому екворін додають прямо до досліджуваного об'єкта і по інтенсивності біолюмінесценції стежать за динамікою зміни вмісту вільного кальцію.

Висновок

Подібно до багатьох інших розділах науки, хемилюминесценция і біолюмінесценція спочатку були об'єктом дослідження, а потім стали методом дослідження інших об'єктів. На сьогоднішній день хімічні та фізичні явища, що лежать в основі чудесного перетворення енергії біохімічних реакцій в

Сторінки: 1 2 3