Головна
Реферати » Реферати по біології » Виникнення злоякісних пухлин

Виникнення злоякісних пухлин

клітини, проникнення Т-ДНК всередину клітини рослини, інтеграція Т-ДНК в геном рослини і експресія Т-ДНК.

Індукція початкових етапів трансформації може відбуватися тільки в місці раневого пошкодження рослини, де виділяються низькомолекулярні фенольні сполуки (наприклад, ацетосірінгон), вуглеводи (наприклад, глюкоза і глюкуроновая кислота) і де утворюється кислий рН. Весь процес вирізання та інтеграції Т-ДНК в рослинну хромосому здійснюють продукти генів, локалізованих в vir-області. Сприйняття ранових сигналів здійснюють білки VirA і ChvE. ChvE, білок, який кодується хромосомним геном бактерії, відчуває присутність ацетосірінгона і змінює здатність VirA відповідати на фенольні сполуки. VirA є гистидинового протеїнкіназою, здатної до аутофосфорілірованію, він двічі пронизує внутрішню мембрану бактеріальної клітини і виступає в якості донора фосфору білку VirG.
Фосфорілірованний VirG активує транскрипцію інших vir-генів.
Індукція vir-генів оборотна, що дуже важливо для патогена: у випадку, якщо господар - хворий і нежиттєздатний організм, перенесення Т-ДНК не здійснюється.

Оперон VirD кодує декілька продуктів. Один з них є двухкомпонентной ендонуклеазою. Область Т-ДНК оточена однаковими повторами довжиною 25 пар основ. Ці послідовності є сайтами впізнавання VirD-ендонуклеази, ріжучої точно між 3-м і 4-м підставами 25 пар основ повтору. Ця ендонуклеаза відповідальна за вирізання Т-ДНК.
Білки VirB і VirE необхідні для транспорту Т-ДНК з бактерії в рослину.
Перенесення Т-ДНК з бактерії в цитоплазму рослинної клітини здійснюється за 30 хв.

Впровадження Т-ДНК в рослинний геном є багатоступеневим процесом. Недавні результати аналізу нуклеотиднихпослідовностей в ділянках рослинної ДНК, в які інкорпорує Т-ДНК, показали, що є гомология між рослинної ДНК по обидва боки від місця вбудовування та зовнішніми областями плазмідної ДНК агробактерій. В геном рослини можуть вбудовуватися кілька копій Т-ДНК. Після вбудовування в хромосому Т-ДНК стає звичайною частиною генома рослини. Т-ДНК транскрибується в рослинних клітинах РНК-полімеразою II рослини-господаря. Транскрипти мають особливості еукаріотичних матриць. Сама бактерія в клітку не проникає, а залишається в міжклітинному просторі і використовує рослинні клітини з вбудованою Т-ДНК як фабрику, продуцирующую опінію - джерело азоту та вуглецю.

2.6. ДНК Ti-Плазміди МОЖНА ВИКОРИСТОВУВАТИ В ЯКОСТІ ВЕКТОРА

Т-ДНК Ti-плазмід володіє двома властивостями, що роблять її по суті ідеальним вектором для введення чужорідних генів у клітини рослин. По-перше, коло господарів агробактерій дуже широкий: вони трансформують клітини практично всіх дводольних рослин. Відомо, що можна добитися зараження однодольних, у тому числі злаків. По-друге, інтегрована до складу генома рослини Т-ДНК успадковується як простий домінантний ознака відповідно до законів Менделя, а її гени мають власні промотори
(регуляторна область гена, що визначає час і місце його експресії) , під контролем яких можуть експресуватися вставлені в Т-ДНК чужорідні гени.

Найпростіший спосіб введення Т-ДНК в клітини рослини полягає в тому, щоб заразити його A. tumefaciens, що містить відповідну Ti-плазміду, та надати подальше природному ходу подій. Необхідно тільки вміти вбудовувати потрібні гени в Т-сегмент ДНК плазміди. Проте розміри цілої Ti-плазміди істотно більше розмірів молекул, звичайно використовуваних в роботі з рекомбінантної ДНК. Щоб подолати ці труднощі, розроблений наступний підхід. Перш за все Т-сегмент вирізують з Ti-плазміди за допомогою рестриктаз і вбудовують в один із стандартних плазмідних векторів для розмноження в клітинах бактерій - Escherichia coli. E. сoli містить плазміду pBR322, яка здатна до самореплікаціі, тобто розмноженню, приводящему до збільшення числа її копій. Після того як в плазміду pBR322 впровадили ділянку Ti-плазміди, це рекомбінантний структура може потім реплицироваться багаторазово, що призводить до збільшення числа копій ділянок
Ti-плазміди. Цей процес називається клонуванням. Бактерії, що містять плазміду pBR322 з ділянкою Т-ДНК, розмножують, після чого цю плазміду виділяють. Потім з використанням рестриктаз і стандартних прийомів роботи з рекомбінантної ДНК в Т-сегмент вбудовують певний ген. Цей молекулярний гібрид, тепер вже містить Т-ДНК з вбудованим в неї геном, знову розмножують в E. сoli, а потім вводять в клітини A. tumefaciens, що несуть відповідну повну Ti-плазміду. В результаті обміну ідентичними ділянками (гомологичная рекомбінація) між Т-сегментами нативної і сконструйованої Ti-плазмід Т-ДНК з вбудованим чужорідним геном включається в Ti-плазміду, заміщаючи нормальну Т-ДНК. Таким чином, ми отримуємо клітини A. tumefaciens, що несуть Ti-плазміду з вбудованим в Т-сегмент потрібним геном. Останній етап полягає у зараженні рослин цими модифікованими генно-інженерними методами агробактерій. Клітини отриманих трансгенних рослин будуть містити інтегровану Т-ДНК з вбудованим чужорідним геном, тобто мета роботи, що складалася у введенні даного гена в геном рослини, буде досягнута. Недавні дослідження, однак, показали, що цю процедуру можна спростити, якщо використовувати бінарні векторні системи, створення яких полягає в тому, що агробактеріальна клітина повинна містити принаймні дві різні модифіковані Ti-плазміди. Одна з них повинна містити тільки vir-область, гени якої будуть брати участь у вирізанні Т-ДНК. Такі плазміди називають плазмидами-помічницями. Друга Ti-плазміда повинна містити область Т-ДНК з потрібним вбудованим геном. Продукти vir-генів здатні вирізати Т-ДНК як на власній плазміді, так і на сусідній, тобто vir-гени можуть працювати незалежно від їхнього місця розташування. Таким чином, якщо клітини агробактерії містять Ti-плазміду з сегментом vir та іншу плазміду з Т-ДНК, що несе вбудований ген, ці бактерії можуть трансформувати клітини рослин.

В цілому ідеальна векторна система на основі Ti-плазміди повинна: ??1) містити всі сигнали, необхідні для перенесення і стабільної інтеграції в ядерну ДНК рослин; систему для експресії чужорідних генів у рослинах
(впізнаваний рослинними полимеразами промотор), маркер, який необхідний для селекції трансформованих клітин; 2) не містити онкогенів, тобто генів, які пригнічують диференціювання рослинних клітин. Другий пункт досягається за допомогою транспозони мутагенезу (транспозон - послідовність ДНК, здатна переміщатися по геному). В результаті введення транспозона в Т-ДНК можна виключити гени, які призводять до пухлиноутворення (iaaM, iaaH, ipt), що не відбивається на механізмі переносу Т-ДНК. Зазвичай використовують бактеріальні транспозони (Tn5, Tn7). При цьому знімається блок з процесів регенерації. При модифікації Ti-плазміди необхідно передбачити також наявність унікальних сайтів рестрикції, в які буде клонований чужорідний фрагмент ДНК. Такі унікальні сайти рестрикції створюються включенням в штучні Ti-конструкції послідовностей, які містять множинні сайти розрізання для рестриктаз EcoR1, Hind III, BamH1 і ін. В деяких випадках в одному множині сайті мається 18-20 сайтів, впізнаваних різними рестриктазами, чому ці ділянки і називаються полілінкерамі.

Крім того, при конструюванні векторних молекул має бути передбачено наявність промоторів, що працюють в рослинах. Промотор
(ділянка, до якого приєднуються РНК-полімерази) повинен володіти набором властивостей, а саме: силою (активної експресією), можливістю регуляції, тканини-і органспеціфіческой експресією. Так, наприклад, до регульованих промоторів відноситься промотор генів білків теплового шоку (генів, активність яких індукується при підвищеній температурі), а тканеспеціфічная експресія характерна для генів, що контролюють синтез запасних білків, наприклад зеина, який виявлений тільки в тканинах насіння злаків. Найбільш популярним є промотор гена вірусу мозаїки цвітної капусти (CAMV). Гени, підшиті до такого промотор, активно експресуються в усіх тканинах.

Нарешті, у векторі повинні бути передбачені маркери, за допомогою яких можливий відбір трансгенних рослин. У літературі маркерні гени ще називають репортерного. Їх досить багато. Наприклад, luxA і luxB - це гени, виділені з ДНК світлячків. Вони контролюють синтез люціферази, яка забезпечує перехід люцефірінов з окисленої форми в основну, що й забезпечує світіння. Останнім часом користується популярністю другий репортерний ген - pgfp, який контролює синтез GFP-білка (green fluorescent protein). Цей ген був виділений з ДНК медузи Acquorea victoria.
Трансгенні рослини з цим геном світяться в ультрафіолеті зеленим світлом.

Традиційний спосіб трансформації рослинних клітин за допомогою Т-ДНК полягає в нанесенні агробактерій, що містять Ti-плазміду, на спеціально пошкоджений втечу. Зараз використовують широкий арсенал методів для отримання трансгенних рослин. Створено навіть спеціальний прилад - "Shotgun", який стріляє найдрібнішими вольфрамовими кульками, одягненими в молекули ДНК, здійснюючи таким чином трансформацію рослинних клітин.

2.7. Практичне застосування генетичної інженерії РОСЛИН С

ВИКОРИСТАННЯМ Ti-ПЛАЗМІД

Ще кілька років тому вчені ставили запитання, чи можна створити сорти, збалансовані за складом амінокислот, стійкі до холоду, посухи, не вражаються шкідниками. Сьогодні можна з упевненістю стверджувати, що такі трансгенні рослини вже вийшли в поле. За літературними даними, до 1997 року в 30 країнах світу проведено понад 3 тис. Польових випробувань. У цих експериментах використовували трансгенні рослини 40 різних видів, що відносяться до різних родин, включаючи злаки. Після успішних експериментів з'явилися побоювання про можливу шкоду генетичної інженерії для природи і людства. Однак вже більш ніж за чверть століття свого існування генетична інженерія не принесла шкоди ні природі, ні людині. Головне, в будь-яких експериментах з генної інженерії слід дотримуватися розроблені правила.

Найбільш гостро стоїть питання про отримання рослин, стійких до шкідників сільського господарства, так як хвороби рослин стали основним лімітуючим фактором отримання врожаю. В арсеналі генної інженерії рослин є багато прийомів, що дозволяють отримати трансгенні рослини, стійкі до комах. Традиційно використовують ген bt, продуктом якого є бактеріальний токсин Bacillus thuringiensis. Ця тюрингская бактерія продукує великий білок (протоксін), контрольований геном bt, який, потрапляючи в кишечник личинок комах, руйнується під дією ферментів, а його фрагмент (ендотоксин) призводить

Сторінки: 1 2 3 4 5 6 7 8