Реферати » Реферати з біології » Історія та методологія клонування

Історія та методологія клонування

Історія та методологія клонування

Ця тема прекрасно відображена у статті Конюхова Бориса Володимировича - доктора біологічних наук, завідувача лабораторією генетики розвитку Інституту загальної генетики імені М.І. Вавілова. Тут я просто наведу її текст:

Доллі - випадковість чи закономірність?

Термін "клон" походить від грецького слова "klon", що означає - гілочка, втеча, держак, і має відношення перш за все до вегетативного розмноження. Клонування рослин живцями, нирками чи бульбами в сільському господарстві, зокрема в садівництві, відомо вже більше 4-х тис. років. Починаючи з 70-х років нашого століття для клонування рослин стали широко використовувати невеликі групи і навіть окремі соматичні (нестатеві) клітини.

Справа в тому, що в рослин (на відміну від тварин) у міру їх зростання в ході клітинної спеціалізації - диференціювання - клітини не втрачають так званих тотипотентних властивостей, тобто не втрачають своєї здатності реалізовувати всю генетичну інформацію, закладену в ядрі. Тому практично будь-яка рослинна клітина, зберегла в процесі диференціювання своє ядро, може дати початок новому організму. Ця особливість рослинних клітин лежить в основі багатьох методів генетики та селекції.

При вегетативному розмноженні і при клонуванні гени розподіляються по нащадкам, як у випадку статевого розмноження, а зберігаються в повному складі протягом багатьох поколінь. Всі організми, що входять до складу певного клона, мають однаковий набір генів і фенотипічно не розрізняються між собою.

Клітини тварин, диференціюючись, позбавляються тотіпотентності, і в цьому - одна з істотних їх відмінностей від клітин рослин. Як буде показано нижче, саме тут - головна перешкода для клонування дорослих хребетних тварин.

Перші досліди на амфібія

Можливість клонування ембріонів хребетних вперше була показана на початку 50-х років в дослідах на амфібія. Американські дослідники Бріггс і Кінг мікрохірургічних метод пересадки ядер ембріональних клітин за допомогою тонкої скляної піпетки в позбавлені ядра (енуклеірованние) яйцеклітини [1]. Вони встановили, що якщо брати ядра з клітин зародка на ранній стадії його розвитку - бластуле, то приблизно в 80% випадків зародок благополучно розвивається далі і перетворюється на нормального пуголовка. Якщо ж розвиток зародка, донора ядра, просунулася на наступну стадію - гаструлу, то лише менш ніж у 20% випадків оперовані яйцеклітини розвивалися нормально. Ці результати пізніше були підтверджені і в інших роботах.

Великий внесок у цю область вніс англійський біолог Гердон. Він першим в дослідах з південноафриканськими жабами Xenopus laevis (1962) в якості донора ядер використав не зародкові клітини, а вже цілком спеціалізувалися клітини епітелію кишечника плаваючого пуголовка [2]. Ядра яйцеклітин реципієнтів він не видаляв хірургічним шляхом, а руйнував ультрафіолетовими променями. У більшості випадків реконструйовані яйцеклітини не розвивалися, але приблизно десята частина з них утворювала ембріони. 6,5% з цих ембріонів досягали стадії бластули, 2,5% - стадії пуголовка і тільки 1% розвинувся в статевозрілих особин (рис. 1). Однак поява кількох дорослих особин в таких умовах могло бути пов'язано з тим, що серед клітин епітелію кишечника розвивається пуголовка досить тривалий час присутні первинні статеві клітини, ядра яких могли бути використані для пересадки. У наступних роботах як сам автор, так і багато інших дослідників не змогли підтвердити дані цих перших дослідів.

Пізніше Гердон модифікував експеримент [3]. Оскільки більшість реконструйованих яйцеклітин (з ядром клітини кишкового епітелію) гинуть до завершення стадії гаструли, він спробував витягнути з них ядра на стадії бластули і знову пересадити їх у нові енуклеірованние яйцеклітини (така процедура називається "серійної пересадкою" на відміну від "первинної пересадки") . Число зародків з нормальним розвитком після цього збільшувалася, і вони розвивалися до більш пізніх стадій в порівнянні з зародками, отриманими в результаті первинної пересадки ядер.

Потім Гердон разом з Ласки (1970) стали культивувати in vitro (поза організмом в живильному середовищі) клітини нирки, легені і шкіри дорослих тварин і використовувати вже ці клітини як донорів ядер [4]. Приблизно 25% первинно реконструйованих яйцеклітин розвивалися до стадії бластули. При серійних пересадках вони розвивалися до стадії плаваючого пуголовка. Таким чином було показано, що клітини трьох різних тканин дорослого хребетного (X. laevis) містять ядра, які можуть забезпечити розвиток принаймні до стадії пуголовка.

У сною чергу ДіБерардіно і Хофнер використовували для трансплантації ядра недслящіхся і полносгью диференційованих клітин крові - еритроцитів жаби Rana pipiens [5]. Після серійної пересадки таких ядер 10% реконструйованих яйцеклітин досягали стадії плаваючого пуголовка. Однак навіть за допомогою багаторазових серійних пересадок (більше 100 клітинних циклів) реконструйовані яйцеклітини далі стадії пуголовка не розвивалися.

Таким чином, у багатьох роботах показано, що у разі амфібій донорами ядер можуть бути лише зародки на ранніх стадіях розвитку. Деякі автори називають подібні експерименти клонуванням амфібій, хоча правильніше називати їх клонуванням ембріонів амфібій, так як в цьому випадку ми розмножуємо безстатевим шляхом не дорослі тварин, а зародків.

Диференціація клітин в ході розвитку хребетних супроводжується інактивацією непрацюючих генів. Тому клітини втрачають тотіпотентность, диференціювання стає незворотною. Зрештою у одних клітин відбувається повне репресування геному, в інших - у тій чи іншій мірі деградує ДНК, а в деяких випадках руйнується навіть ядро. Однак поряд з диференційованими Кочетков культивовані in vitro клітинні популяції містять малодиференційовані стовбурові клітини, які й можуть бути використані як донори ядер для клонування ссавців.

Досліди з амфібіями показали, що ядра різних типів клітин одного і того ж організму генетично ідентичні і в процесі клітинної диференціювання поступово втрачають здатність забезпечувати розвиток реконструйованих яйцеклітин, однак серійні пересадки ядер і культивування клітин in vitro в якій-то мірі збільшує цю здатність.

Невдачі експериментів з мишами

Успішні досліди з амфібіями змусили вчених задуматися про клонування ембріонів ссавців, зокрема мишей. МакКіннел в одній зі своїх робіт зазначав, що всі необхідні для цього методи вже існують, і незрозуміло, чому миша до цих пір не клонована. На його думку, першими об'єктами повинні були стати саме дрібні тварини, такі як миша або кролик. Однак пророкування МакКиннелла не збулося, хоча наприкінці 70-х років досліди на мишах дійсно почалися і протікали дуже драматично. До того часу, зауважу, дуже грунтовно були вивчені біологія і генетика ранніх етапів розвитку ссавців, і, зокрема, миші як модельного об'єкта.

Робота методично виявилася досить важким, насамперед тому, що обсяг яйцеклітини у ссавців приблизно в тисячу разів менше, ніж у амфібій. Однак ці труднощі були успішно подолані. Експериментатори навчилися мікрохірургічних видаляти пронуклеус [6] з зигот (запліднених яйцеклітин) миші і пересаджувати в них клітинні ядра ранніх ембріонів. Проте всі отримані різними способами зародки мишей розвивалися лише до стадії бластоцисти [7].

6. Пронуклеус - одне з двох гаплоїдних ядер в яйці ссавців у період після проникнення сперматозоїда, але до злиття чоловічого і жіночого пронуклеусов в ядро ??зиготи в процесі запліднення. Чоловіче ядро ??формується з ядерного матеріалу сперматозоїда, жіноче - з хромосом яйцеклітини.

7. Бластоциста (бластула) - зародок ссавців на одній з ранніх стадій розвитку, ще до його імплантації в матку.

У 1977 році з'явилося сенсаційне повідомлення Хоппе і Ілменсі про те, що вони отримали сім дорослих самок мишей, п'ять з яких мали голько магерінскій, а два - батьківський геном [8]. Це, нібито, залежало від гого, який пронуклеус був залишений в яйці - жіночий або чоловічий, він і визначав розвиток особини але типу гиногенеза або андрогенеза. Їх успіх був пов'язаний, але описом авторів, з гем, що, видаляючи один нронуклеус, вони подвоювали число хромосом іншого, обробляючи яйця спеціальною речовиною, потім вирощували отримані диплоїдні гомочіготние (з двома однаковими наборами генів) зародки in vitro до стадії бластоцисти і пересаджували в матку самки-реципієнта для подальшого розвитку.

Здавалося, тепер можна буде швидко отримувати ссавців зі 100%-ної гомозиготностью по всіх генам. Це особливо важливо в селекції, так як для отримання сільськогосподарських тварин, зокрема, великої рогатої худоби, із закріпленими особливо цінними якостями звичайними прийомами потрібні десятки років роботи.

Однак, на жаль, дані Хоппе і Ілменсі підтвердити не вдалося, хоча багато хто намагався це зробити. Виявилося, що отримані будь-яким способом диплоїдні андрогенетичним та гіногенетіческіе зародки мишей гинуть на тих же стадіях, що і диплоїдні партеногенетические (що розвиваються з незаплідненої яйцеклітини) ембріони.

Значно удосконаливши методи добування ядер і введення їх в клітку, МакГрат і Солтер провели свою серію експериментів і повідомили, що високий вихід живих мишей вони отримали, коли як донорів ядер використовували зиготи, але якщо донорами були ранні ембріони, то реконструйовані яйцеклітини, як і раніше, розвивалися лише до стадії бластоцисти [9].

Метод МакГрата і Солтер став широко використовуватися різними експериментаторами. Так, Манн і ловель-Бадж виділяли пронуклеус з яєць, активованих до партеногенезу, і пересаджували їх енуклеірованние зиготи мишей [10]. У цих випадках ембріони гинули на ранніх стадіях. Якщо ж навпаки, пронуклеус отримували з запліднених яєць і пересаджували в партеногенетически активовані та позбавлені ядра яйця, то такі зародки розвивалися нормально до народження. Сурані з співавторами встановили, що якщо додати жіночий пронуклеус з зиготи миші до гаплоидному набору хромосом яйцеклітини,

Сторінки: 1 2 3 4 5

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар