Реферати » Реферати по біології » Історія та методологія клонування

Історія та методологія клонування

то нормального розвитку не відбувається, додавання ж чоловічого ядра призводить до нормального розвитку [11]. З іншого боку, рекомбінації чоловічого і жіночого пронуклеусов з різних запліднених яйцеклітин мишей забезпечує нормальний розвиток, а комбінація двох чоловічих або двох жіночих пронуклеусов зупиняє розвиток ембріона [12].

Ці досліди показали, що для нормального розвитку ссавців потрібні два набору хромосом - батьків і материнський. Тому ні у одного з відомих видів ссавців не описаний партеногенез. Тому роботи Хоппе і Илменси не вдалося повторити.

Проте ці дослідники ще двічі розбурхували наукове співтовариство. У 1982 році вони пересадили ядра клітин партеногенетических бластоцист мишей венуклеірованние зиготи Деякі з цих реконструйованих яйцеклітин нормально розвивалися, і нібито були отримані чотири дорослих самки. У світлі вищесказаного ці результати досить малоймовірні.

Загибель партеногенетических (гиногенетических) і андрогенетических зародків у ссавців пов'язана з різною активністю в онтогенезі материнського і батьківського геномів. Механізм, який регулює ці функціональні відмінності, був названий геномних импринтингом [13] і вивчався у ряді робіт, де було показано, що для нормального розвитку ссавців потрібно наявність чоловічого геному. Інша стаття Илменси і Хоппе [14] мала ще більший резонанс.

Автори повідомили про пересадку ядер клітин внутрішньої клітинної маси бластоцисти венуклеірованние зиготи мишей та одержання трьох дорослих мишей (двох самок і самця), генетично ідентичних донорської лінії мишей. Введення ядер-донорів та видалення пронуклеусов з зиготи проводили за один прийом, потім реконструйовані яйцеклітини культивували in vitro до стадії бластоцисти і пересаджували в матку самок. З 16-ти пересаджених бластоцист три розвинулися у дорослих тварин. У наступній роботі (1982) ці ж автори використовували як донорів ядер клітини ембріонів ще більш пізніх стадій (7 діб) і нібито отримали трьох статевозрілих мишей. Однак ніхто з працюючих в тому ж напрямку не зміг домогтися подібних результатів, і достовірність даних Илменси і Хоппе була знову поставлена ??під сумнів.

МакГрат і Солтер показали, що ядра 8-клітинних зародків і клітин внутрішньої клітинної маси бластоцисти не забезпечують розвиток in vitro реконструйованих яйцеклітин до стадії морули, яка передує стадії бластоцисти [15]. Невелика частина (5%) ядер 4-клітинних зародків дає можливість розвиватися тільки до стадії морули. У той же час 19% реконструйованих яйцеклітин, що містять ядра 2-клітинних зародків, змогли досягти стадії морули або бластоцисти.

Ці та багато інших дані показують, що в ембріогенезі у мишей клітинні ядра рано втрачають тотипотентність, що пов'язано очевидно, з дуже ранньої активацією геному зародка - вже на стадії 2-х клітин. У інших ссавців, зокрема, у кроликів, овець і великої рогатої худоби, активація першої групи генів в ембріогенезі відбувається пізніше, на 8-16-клітинної стадії. Можливо тому перші значні успіхи в клонуванні ембріонів були досягнуті на інших видах ссавців, а не на мишах. Проте, роботи з мишами, незважаючи на їх непросту долю, значно розширили наші уявлення про методологію клонування ссавців.

Кролики, корови і свині

Американські ісследонателі Стік і роблю, використовуючи методику МакГрата і Солтера, отримали 6 живих кроликів, пересадивши ядра 8клеточних ембріонів однієї породи в позбавлені ядра яйцеклітини кроликів іншої породи [16]. Фенотип народжених цілком відповідав фенотипу донора.

Однак тільки 6 з 164 реконструйованих яйцеклітин (3,7%) розвинулися в нормальних тварин. Це, звичайно, дуже низький вихід, практично не дозволяє одержання таким методом клону генетично ідентичних тварин. Цінність цієї роботи тим не менш в тому. що вона показала можливість клонування ембріонів кроликів.

Робота з реконструйованими яйцеклітинами великих домашніх тварин, корів або овець, йде дещо по-іншому. Їх спочатку культивують НЕ in vitro, a in vivo - в перев'язаному яйцеводе вівці - проміжного (першого) реципієнта. Потім їх звідти вимивають і трансплантують в матку остаточного (другого) реципієнта - корови чи вівці відповідно, де їх розвиток відбувається до народження дитинчати. Уиладсин запропонував укладати реконструйовані яйцеклітини в агарових циліндр, який він потім трансплантували в перев'язаний яйцепровід вівці [17]. За даними одних авторів реконструйовані зародки краще розвиваються в яйцеклітині, ніж в культуральної середовищі, хоча деякі дослідники отримали непогані результати і при культивуванні.

Американці Роблю і його працівники, використовуючи щадний метод вилучення ядра без проколювання мембрани яйцеклітини, запропонований МакГрат і Солтером, пересаджували в зиготи так звані каріопласти - чоловічий і жіночий пронуклеуси разом з навколишнім їх цитоплазмою, а також ядра 2-, 4- або 8-клітинних ебріонов корови [18]. Спочатку зиготи центрифугировали щоб звільнити пронуклеуси від оточуючих їх гранул жовтка, після чого ядра були добре видні під мікроскопом (рис. 2а), що значно полегшувало їх видалення (рис. 2б). За допомогою маніпулятора і загостреною скляній микропипетки витягували один з бластомерів разом з ядром з ранніх зародків (рис. 2в) і переносили його в енуклеірованную зиготу (рис. 2г).

Реконструйовані зародки були укладені в агарових циліндр і пересаджені в перев'язаний яйцепровід вівці. Через п'ять днів культивування їх вимивали, звільняли від агару і досліджували. Реконструктурірованние зародки в цій роботі розвивалися тільки в тих випадках, коли в зиготи пересаджували пронуклеуси: 17% таких зародків досягли стадії морули або бластоцисти. Два зародка були пересаджені другому реципієнту - в матку корови, і розвиток їх завершилося народженням живих телят. Якщо в якості донорів використовували ядра 2, 4- або 8-клітинних зародків, то реконструйовані яйцеклітини не розвивалися до стадії морули.

Пізніше були і більш успішні роботи. Уиладсин, зокрема. повідомив, що йому вдалося отримати чотирьох генетично ідентичних бичків холстейнской породи в результаті пересадки в реціпіентние яйцеклітини ядер бластомерів одного 32-клітинного зародка [19] (рис. 3). Автор стверджував, що більшість ядер зберігає тотипотентність на 32-клітинній стадії, а значна їх частина навіть на 64-клітинній стадії, забезпечуючи нормальний розвиток реконструйованих яйцеклітин до стадії ранньої бластоцисти в яйцепровід вівці. Після пересадки в матку корів - остаточних реципієнтів, як вважає автор, вони можуть і далі нормально розвиватися.

Бондіолі і співавтори, використовуючи як донорів ядер 16-64-клітинні зародки корів, трансплантували 463 реконструйованих зародка в матку синхронізованих реципієнтів, і було отримано 92 живих теляти [20]. Сім з них були генетично ідентичні, бувши клон, отриманий в результаті пересадки ядер клітин одного донорського ембріона.

Таким чином, клітинні ядра зародків великої рогатої худоби досить довго зберігають тотипотентність і можуть забезпечити повний розвиток реконструйованих яйцеклітин. Інакше кажучи, методичні труднощі клонування зародків великої рогатої худоби практично вирішені. Але залишається основне завдання - знайти донорські ядра, що володіють тотипотентностью, для клонування дорослих тварин.

Клонування ембріонів свиней присвячена тільки одна невелика робота [21]. Убогість даних, відімо.і пов'язана з певними труднощами роботи з цим об'єктом.

Клонування овець

Уиладсин ще в 1986 році показав, що і в ембріонів овець на 16-клітинній стадії розвитку ядра зберігають тотипотентність [22]. Реконструйовані яйцеклітини, містять ядра бластомерів 16-клітинних зародків, розвивалися нормально до стадії бластоцисти в перев'язаному яйцеводе вівці (в агарових циліндрі), а після звільнення з агару і пересадки в матку вівці - другого реципієнта - ще 60 днів. В іншому випадку донорами служили ядра 8-клітинних зародків і були отримані 3 живих ягняти, фенотип яких соотнетстіовал породі овець - донорів.

У 1989 році Сміт і Уилмут трансплантували ядра клітин 16-клітинного ембріона і ранньої бластоцисти в позбавлені ядра незапліднені яйцеклітини овець [23]. У першому випадку було отримано два живих ягняти, фенотип яких відповідав породі овець - донорів ядер. У другому випадку один повністю сформувався ягня загинув під час пологів. Його фенотип також відповідав породу - донору. Автори вважали, що в ході диференціювання ембріональних клітин відбувається інактивація деяких важливих для розвитку генів, в результаті якої ядра бластоцисти вже не можуть репрограммироваться в цитоплазмі яйцеклітини і забезпечити нормальний розвиток реконструйованого зародка. Тому, на думку авторів, як донорів ядер краще використовувати 16-клітинні ембріони або культивовані in vitro лінії ембріональних клітин, ядра яких мають тотипотентностью.

Пізніше, в 1993-1995 роках, група дослідників під керівництвом Уилмута отримала клон овець - 5 ідентичних тварин, донорами ядер яких була культура ембріональних клітин [24]. Клітинну культуру отримували наступним чином: виділяли мікрохірургічних ембріональний диск з 9-денного овечого ембріона (бластоцисти) і культивували клітини in vitro протягом багатьох пасажів (принаймні до 25). Спочатку клітинна культура нагадувала культуру стовбурових недиференційованих ембріональних клітин, але незабаром, після 2-3-х пасажів, клітини ставали ущільненими і морфологічно подібними з епітеліальними. Ця лінія клітин з 9-денного зародка вівці була позначена як TNT4.

Щоб донорське ядро ??і реципиентная цитоплазма перебували на східних стадіях клітинного циклу, зупиняли поділ культивованих клітин TNT4 на певній стадії (GO) і ядра цих клітин пересаджували в енуклеірованние яйцеклітини (відповідно на стадії метафази II). Реконструйовані ембріони укладали в агар і трансплантували в перев'язані яйцепроводи овець. Через 6 днів ембріони вимивали з яйцевода першого реципієнта і досліджували під мікроскопом. Відбирали ті, які досягли стадії морули або бластоцисти і пересаджували їх в матку вівці - остаточного реципієнта, де розвиток тривало до народження. Народилося 5 ягнят (самок) з них 2 загинули незабаром після народження, 3-й у віці 10 днів, а 2 залишилися нормально розвивалися і досягли 8-9-місячного віку. Фенотипічно

Сторінки: 1 2 3 4 5

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар