Головна
Реферати » Реферати з біології » Визначення активності ферментів

Визначення активності ферментів

Російський хіміко-технологічний Університет ім. Д.И.Менделеева

Кафедра промислової біотехнології

МЕТОДИЧНА РОБОТА

З ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТІВ

Виконала: студентка групи Е-35

Тимошкина Е.А.

Викладач:

Мартімьянова Н.А.

Москва, 1996 г

ЗМІСТ

Властивості ферментів як біологічних каталізаторів. 1

Отримання ферментних препаратів. 4

Загальні методи визначення активності ферментів. 6

Методи визначення активності протеолітичних ферментів 11

Література 19

Властивості ферментів як біологічних каталізаторів.

Фермент - від лат. fermentum - закваска; знзімов - від грец. ен - всередині, зими - закваска.

Ферменти, або ензими, - це каталізатори білкової природи, що утворюються і функціонують у всіх живих організмах. Походження термінів пов'язане з тим, що спочатку ферментативні процеси були відкриті і вивчені в бродильному виробництві. У кожній клітині є сотні різних ферментів. З їх допомогою здійснюються багато хімічні реакції, які можуть з великою швидкістю йти при температурах, відповідних для даного організму, тобто в межах від 5 до 400 С. Щоб ці реакції з тією ж швидкістю протікали поза організмом, потрібні були б високі температури і різкі зміни деяких інших умов. Для клітини це означало б загибель, так як вся робота клітини будується таким чином, щоб уникнути будь-яких скільки-небудь помітних змін в нормальних умовах її існування. Отже, ферменти можна визначити як біологічні каталізатори, тобто як речовини, що прискорюють реакції. Вони абсолютно необхідні, тому що без них реакції в клітинах протікали б занадто повільно і не могли підтримувати життя.

Сукупність біохімічних реакцій, каталізуються ферментами, становить сутність обміну речовин, є відмінною рисою всіх живих організмів. Через ферментативний апарат, регуляцію його активності відбувається і регуляція швидкості метаболічних реакцій, їх спрямованості.

Будучи каталізаторами, ферменти мають ряд спільних з небиологическими каталізаторами властивостей:

1. Ферменти не входять до складу кінцевих продуктів реакції і виходять з неї, як правило, у початковому вигляді, тобто вони не витрачаються в процесі каталізу (нині доведено, що деякі ферменти наприкінці хімічної реакції піддаються модифікації і навіть розпаду, а не звільняються в незмінному вигляді, як постулював Л. Міхаеліс).

2. Ферменти не можуть порушити ті реакції, перебіг яких суперечить законам термодинаміки, вони прискорюють тільки ті реакції, які можуть протікати і без них.

3. Ферменти не зміщувати положення рівноваги, а лише прискорюють його досягнення.

Специфічні властивості:

1. Звичайно ж, за своїм хімічним будові всі ферменти є білками.

2. Ефективність ферментів набагато вище, ніж небіологічних каталізаторів (швидкість протікання реакції за участю ферменту вище на кілька порядків).

3. Ферменти мають вузькою специфічністю, вибірковістю дії на субстрати, тобто на речовини, перетворення яких вони каталізують.

Висока специфічність ферментів обумовлена ??конформаційної і електростатичного комплементарностью між молекулами субстрату і ферменту і унікальною структурою активного центру ферменту, що забезпечують "впізнавання", високу спорідненість і вибірковість протікання однієї якої-небудь реакції з тисячі інших хімічних реакцій, здійснюються одночасно в живих клітинах.

Залежно від механізму дії розрізняють ферменти з відносною (або груповий) специфічністю і абсолютною специфічністю. Так, для дії деяких гідролітичних ферментів найбільше значення має тип хімічного зв'язку в молекулі субстрату.

Наприклад, пепсин розщеплює білки тваринного і рослинного походження, хоча вони можуть істотно відрізнятися один від одного як за хімічною будовою і амінокислотним складом, так і за фізико-хімічними властивостями. Однак пепсин не розщеплюється вуглеводи або жири.

Пояснюється це тим, що місцем дії пепсину є пептидная-СО-

NH-зв'язок. Для дії ліпази, що каталізує гідроліз жирів на гліцерин і жирні кислоти, таким місцем є складноефірний зв'язок.

Аналогічної відносної специфічністю володіють також деякі внутрішньоклітинні ферменти, наприклад гексокіназа, каталізує у присутності АТФ фосфорилювання майже всіх гексоз, хоча одночасно в клітинах є специфічні для кожної гексози ферменти, що виконують таке ж фосфорилування.

Абсолютною специфічністю дії називають здатність ферменту каталізувати перетворення тільки єдиного субстрату. Будь-які модифікації в структурі субстрату роблять його недоступними для дії ферменту.

Стереохімічна специфічність ферментів обумовлена ??існуванням оптично ізомерних L-і D-форм або геометричних (цис-і транс-) ізомерів хімічних речовин. "Так, відомі оксидази L-і D-амінокислот, хоча в природних білках виявлені тільки L-амінокислоти.

Кожен з видів оксидаз діє тільки на свій специфічний стереоізомер.

+ ЅО2

L-амінокислота a-кетокислот + NH3 + H2O оксидаза L-амінокислот

+ ЅО2

D-амінокислота a-кетокислот + NH3 + H2O оксидаза D-амінокислот

Наочним прикладом стереохимической специфічності є бактеріальна аспартатдекарбоксілаза, каталізує відщеплення СО2 тільки від L-аспаргиновой кислоти з перетворення її в L- аланін "[1].

4. Регульованість ферментів як біокаталізаторів. "Через регуляцію ферментативного апарату здійснюється скоординованість всіх метаболічних процесів в часі і просторі, спрямоване на відтворення живої метер, підтримання сталості внутрішньоклітинного середовища, на пристосування до мінливих зовнішніх умов" [2].

5. Термолабільність ферментів. Швидкість хімічних реакцій залежить від температури, тому каталізуються ферментами реакції також чутливі до змін температури. Однак внаслідок білкової природи ферменту теплова денатурація при підвищенні температури буде знижувати ефективну концентрацію ферменту з відповідним зниженням швидкості реакції. Таким чином, термолабильность, або чутливість до підвищення температури є одним з характерних властивостей ферментів, що різко відрізняють їх від неорганічних каталізаторів. При 1000С майже всі ферменти втрачають свою активність (виняток становлять, очевидно, тільки один фермент м'язової тканини - міокіназа, яка витримує нагрівання до 1000С). При низьких температурах (00С і нижче) ферменти, як правило, не руйнуються, хоча активність їх падає майже до нуля. У всіх випадках має значення час дії відповідної температури. В даний час для пепсину, трипсину і ряду інших ферментів доведено існування прямої залежності між швидкістю інактивації ферменту і ступенем денатурації білка. На термолабильность ферментів певний вплив роблять концентрація субстрату, рН середовища та інші чинники.

6. Залежність активності ферментів від рН середовища. Ферменти зазвичай найбільш активні в межах вузької зони концентрації водневих іонів, відповідної для тварин тканин в основному виробленим в процесі еволюції фізіологічним значенням рН середовища 6.0 - 8.0. рН-оптимум дії ферментів лежить в межах фізіологічних значень. Виняток становить пепсин, рН-оптимум якого дорівнює 2.0. Пояснюється це тим, що пепсин входить до складу шлункового соку, що містить вільну соляну кислоту, яка створює оптимальну кисле середовище для дії цього ферменту. З іншого боку, рН-оптимум аргінази лежить в сильно лужний зоні (близько 10.0); такого середовища немає в клітинах печінки, отже, in vivo аргінази функціонує, мабуть, не в своїй оптимальній зоні рН середовища. Вплив змін рН середовища на молекули ферменту полягає у впливі на стан і ступінь іонізації кислотних і основних груп (СООН-групи дикарбонових амінокислот, SH-групи цистеїну, імідазольного азоту гістидину та ін.) При різних значеннях рН середовища активний центр може знаходитися в частково іонізованої або в неіонізованій формі, що позначається на третинної структурі білка і відповідно формуванні активного фермент-субстратного комплексу. Крім того, має значення і стан іонізації субстратів і кофакторів.

Отримання ферментних препаратів.

Для отримання ферментних препаратів використовують як мікроскопічні гриби, так і бактерії і дріжджі. Іноді отримання технічного ферментного препарату закінчується проведенням процесу ферментації, наприклад, в спиртовій промисловості для оцукрювання крохмалю використовують рідку культуру Aspergillus niger. Згодом її додають в рідкому вигляді в кількості 10-12% до осахареваемому затору.

Проте активність ферментів в культуральній рідині швидко знижується.

Тому широко практикують отримання сухих технічних ферментних препаратів.

Технічні препарати ферментів. Комплексний амілолітичною ферментний препарат отримують шляхом вирощування цвілевих грибів на твердому живильному середовищі з подальшою сушкою і подрібненням отриманої маси. Більш активний препарат ферменту отримують шляхом екстракції такого

"грибного солоду" з подальшим випаровуванням і сушкою. Ще більш активні ферментні препарати можна виділити з культуральної рідини шляхом осадження амілази ацетоном і подальшим висушуванням коагулятом при температурі 27-270С. Для осадження ферменту часто використовують і сульфат амонію. Попередньо культуральну рідина випарюють при температурі 400 С до 40%-ного змісту сухих речовин. Коагулят сушать разом з наповнювачем.

Комплекс ферментів протеолітичної і амилолитического дії отримують за допомогою культури Bacillus subtilis. Це аеробні, грампозитивні, рухливі палички. Для цих бактерій характерний дуже багатий комплекс гідролітичних ферментів. Як джерела живлення вони можуть використовувати білки, вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Bacillus subtilis культивують як методом поверхневого культивування на висівках, так і в рідких середовищах

Сторінки: 1 2 3 4