Реферати » Реферати з біології » Визначення активності ферментів

Визначення активності ферментів

особливого складу за методом глибинного культивування.

Целлюлолітіческіе ферментні препарати. Виробництво целлюлаз грунтується на використанні культури гриба Trichoderma viride.

Існуючі в даний час способи отримання целлюлаз в глибинній культурі передбачає вирощування мікроорганізмів-продуцентів целлюлаз на живильному середовищі, що містить як джерела вуглецю, як правило, очищену целюлозу, або ж містять її природні субстрати.

Але отримання целюлази з використанням як основного компонента середовища природної целюлози (наприклад, деревна тирса) пов'язане з рядом технологічних труднощів. Більш раціонально використання живильного середовища, що містить розчинний "індуктор". Такий живильним середовищем може бути молочна сироватка, основним компонентом якої є лактоза

(попередньо від молочної сироватки відокремлюють білок). В якості продуцента може бути використаний гриб Trichoderma lignorum, що дозволяє отримати весь комплекс целлюлолитических ферментів, необхідний для розщеплення природних целлюлозусодержащіх субстратів.

Загальні методи визначення активності ферментів.

Перш ніж переступити до виділення ферменту, необхідно обрати і ретельно відпрацювати метод визначення активності, під контролем якого проводиться вибір найбільш ефективних прийомів очищення ферментів, а потім і виконання послідовних стадій його препаративного отримання. Активність ферменту змінюється при різних умовах реакції і залежить від температури, рН середовища, від концентрацій субстратів і кофакторів. Враховуючи це, при визначенні активності ферменту на різних стадіях очищення необхідно суворо дотримуватися одні й ті ж умови. Бажано не обмежуватися визначенням активності по одному якомусь методу. Кількість субстрату, що перетворювався в умовах тесту з визначення активності ферменту, має бути пропорційно кількості останнього і часу інкубування. Якщо ж немає такої пропорційності, то активність розраховують за попередньо побудованому калібрувальним графіком, отражающему залежність швидкості реакції від кількості одиниць ферменту. Коли хід реакції нелинеен в часі, слід визначати початкову швидкість реакції (по тангенсу кута нахилу дотичної до початкового відрізку кривої перетворення). Для цього найлегше застосовувати такі методи зміни активності, які дозволяють безперервно стежити за ходом перетворення у часі: спектрофотометричні методи, потенціометричні, полярографічні і т.п. Для вимірювання швидкості ферментативної реакції необхідно вибрати буфер, який не гальмує досліджувану активність і забезпечує підтримку рН розчину, близької до оптимальної для даного ферменту. Реакцію проводять при температурі, що лежить в більшості випадків в межах 25-400С. При дослідженні ферментів, що вимагають присутності кофакторів (іонів металів, коферментів та ін), концентрація яких може знижуватися в міру очищення ферменту, в реакційну суміш слід додавати відсутні кофактори, наприклад солі металів, АТФ, НАДФ і т.п. Також для визначення активності ферментів вводять стабілізатори до складу досвідчених сумішей. У багатьох випадках додавання желатину, альбуміну та інших добавок запобігає денатурацію ферментного білка.

Спектрофотометричні методи. Спектрофотометричні методи засновані на поглинанні світла в певних ділянках спектру багатьма сполуками, які є активними групами ферментів, субстратами або продуктами реакції. Положення максимуму поглинання при певній довжині хвилі визначається наявністю в досліджуваному матеріалі певних груп - аналітичних форм. Для вимірювання спектрів використовують спеціальні прилади - спектрофотометри, фотометричні абсорбціометри та ін Цей метод відрізняється високою чутливістю, швидкістю визначення, малим витрачанням ферменту і реактивів і дозволяє стежити за перебігом реакції у часі. Для цього реакційну суміш поміщають в кювету, вставлену в термостатіруємий кюветодержатель. Через малий проміжок часу після додавання ферменту (або субстрату) і швидкого перемішування вимірюють поглинання при довжині хвилі, характерної для використовуваного субстрату або кінцевого продукту, що утворюється в даній реакції. За допомогою спектрофотометричного методу можна вимірювати безпосередньо концентрацію деяких ферментів (після достатньої очищення) за величиною характерних максимумів поглинання міцно пов'язаних коферментів (простетичної груп). Необхідно мати довільно вибрану одиницю ферменту, за допомогою якої можна було б кількісно виразити чистоту і активність різних фракцій. У більшості випадків вибір одиниці залежить від обраного методу визначення. У разі спектрофотометричних методу такою одиницею може служити кількість ферменту, що викликає певну зміну в оптичної щільності за певний час за даних умов досвіду; якщо визначається продукт реакції, то одиницею буде кількість ферменту, що викликає утворення певної кількості речовини в хвилину, і т.д. Тоді питому активність ферменту, яка є мірилом чистоти ферментного препарату, виражають числом одиниць в 1 мг речовини (білка).

Для цілей визначення ферментів можуть бути використані не тільки вимірювання поглинання світла, але також вимірювання флюоресценції - спектрофлюорометріческіе методи. Таке визначення активності ферменту в ряді випадків по чутливості перевершує спектрофотометричні методи на цілий порядок величини. Деякі коферменти і субстрати мають сильну флюоресценцией. НАД і НАДФ у відновленому стані мають сильну флюоресценцію і не флюоресцируют в окисленні стані.

Тому спектрофлюорометрію використовують для вивчення кінетики і механізму дії нікотінамідних і флавинових ферментів.

Колориметричні (фотометричні) методи. В основі цих методів лежить вимірювання за допомогою візуального або фотоелектричного колориметра пофарбованого продукту, що утворюється при взаємодії субстрату або продукту дії ферменту зі специфічними реактивами, які зазвичай додаються в фіксовану дослідну пробу, взяту після зупинки ферментативної реакції. Ці методи дуже різноманітні.

Розроблено кількісні методи, засновані на биуретовой реакції, при якій складу білка, очевидно не повинен позначатися на результатах визначення, т.к. ця реакція на пептидні зв'язки, а не на бічні групи в білку. Метод Горнелла і співавторів, заснований на вимірюванні смуги поглинання в області 550-650 нм, використовується для визначення значних кількостей (1-10 мг) білка в пробі. Пропонуються біуретового мікрометоди, засновані на поглинанні ультрафіолетових променів мідно-білковими комплексами: вони дозволяють визначати 0.1 - 2.0 мг білка в пробі. Число небілкових речовин, які можуть впливати на визначення за допомогою биуретовой реакції, невелика, але слід вносити поправки на ті речовини, які присутні в високим концентраціях (солі амонію, сахароза). Найбільш цінними є ті фотометричні методи, які дозволяють стежити в часі за ходом ферментативної реакції без її припинення щодо зміни забарвлення хромогенного субстрату або доданого індикатора. Метод Фолина і Чіокальто, запропонований для визначення кількості білка, заснований на хромогенні природі деяких бокових груп амінокислот, а також на присутності в білках пептидних зв'язків. Цей метод має високу чутливість (на пробу досить 0.01 - 0.1 мг білка), але багато небілкових речовини заважають визначенням.

В даний час для визначення кількості білка широко користуються вимірюваннями інтенсивності поглинання світла при 280 нм, що обумовлено присутністю в білку ароматичних амінокислот.

Кількість цих амінокислот у різних білках різному і, отже, інтенсивність неоднакова. У кюветі товщиною 1 см у розчину, що містить 1 мг "усередненого" білка в 1 мл, оптична щільність дорівнює

1 при довжині хвилі 280 нм. Нуклеїнові кислоти поглинають при 280 нм, але можна зробити поправку на їх присутність, проводячи вимірювання і при 260 нм і при 280 нм. Дуже важлива швидкість вимірювання активності ферментів. Те ж відноситься і до вимірювання кількості сухого залишку або кількості білка.

Тим самим віддають перевагу швидкому метод визначення білка шляхом вимірювання величини поглинання при 280 нм. Виграний час важливіше, за рахунок того, що питоме поглинання виділяється білка іноді значно відрізняється від середньої величини поглинання суміші білків, присутніх у вихідному матеріалі.

Манометричні методи. Ці методи використовуються при визначенні активності ферменту в тих випадках, коли в досліджуваних реакціях один з компонентів знаходиться в газоподібному стані. До таких реакцій відноситься головним чином ті, які пов'язані з процесами окислення і декарбоксилювання, що супроводжуються поглинанням або виділенням кисню і вуглекислоти, а також реакції, в яких виділення або зв'язування газу відбувається в результаті взаємодії продуктів ферментативного перетворення з доданим до системи реактивом.

Спостереження за ходом реакції у часі проводиться в спеціальних приладах

- манометричних апаратах Варбурга.

Інші методи. Сюди відноситься великий ряд методів, що включають поляриметрії, віскозиметрі, потенцио-і кондуктометричні вимірювання і т.п. Також визначення активності можна виконувати, використовуючи методи хроматографії та електрофорезу на папері. Ці методи високочутливі і специфічні, що робить їх у багатьох випадках незамінними; вони дозволяють значно скоротити витрату ферменту на вимірювання активності, але не завжди застосовні через тривалості розділення речовин у процесі хроматографії (та електрофорезу).

Спеціальні методи визначення активності пепсину і папаїну. Пепсин і папаїн відносяться до однієї з найбільш численних груп ферментів - протеолітичні ферменти (протеази). Вони належать до класу гідролаз, до підкласу пептідгідролаз і каталізують розщеплення білків і поліпептидів

Сторінки: 1 2 3 4

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар