Реферати » Реферати з біології » Визначення активності ферментів

Визначення активності ферментів

відповідно до рівнянням:

R1CONHR2 + H2O ® R1COOH + H2NR2,

R1 і R2 - залишки амінокислот, ди-або поліпептиди.

Тобто протеази каталізують розщеплення пептидного зв'язку ѕCOѕNHѕ.

Тепер трохи докладніше про пептідгідролаз.

Підклас пептідгідролаз ділиться на наступні групи:

1. Амінопептидази (a-аміноацілпептідгідролази) каталізують гідроліз поліпептидів за місцем пептидного зв'язку, знаходиться поруч з вільною аминной групою. дію

R1 ферменту R2

| Ї |

H2N ѕ C ѕ C ѕ NH ѕ C ѕ C ѕ

| є | є

HOHO

2. карбоксипептидази (пептіділамінокіслотние гідролази) каталізують розщеплення поліпептидів за місцем пептидного зв'язку, знаходиться поруч з вільною гідроксильною групою.

R

Ї | ѕCOѕNHѕCѕH

| дію COOH ферменту

3. Діпептідази (діпептідгідролази) каталізують гідролітичні розщеплення на вільні амінокислоти.

NH2CH2CONHѕCH2ѕCOOH + H2O ® 2CH2NH2COOH гліцил-гліцин гліколол

дипептидаза розщеплюють тільки такі пептидні зв'язку, по сусідству з якими знаходяться одночасно вільні карбоксильная і аминная групи. Великий вплив на дію дипептидаз надає наявність a-водневих атомів, що знаходяться у атомів вуглецю, пов'язаних з вільною карбоксильною і аминной групами. При заміні цих атомів іншими угрупованнями активність ферментів знижується або зовсім зникає.

4. Протеїнази - (пептіділгідролази) гідролізують безпосередньо білок.

При цьому утворюються поліпептиди і вільні амінокислоти. До цієї підгрупи протеїназ належить пепсин, трипсин, хімотрипсин, папаїн та ін У процесі дії ферментів на субстрати вирішальну роль відіграє структура молекул субстрату (відповідна частина молекули субстрату), в якій відбувається розрив. Характер розпаду білкової молекули на пептиди і амінокислоти залежить від природи субстрату і зовнішніх умов

(рН, температури та ін.) Як білкових субстратів використовують желатин, гемоглобін, казеїн, сироватковий альбумін.

Методи визначення активності протеолітичних ферментів

Модифікаційний метод. Модифікаційний метод із застосуванням субстрату казеїну заснований на визначенні швидкості ферментативної реакції гідролізу субстрату під дією досліджуваних протеолітичних ферментів, що містяться в матеріалі, взятому на аналіз. Швидкість реакції визначають за кількістю утворилися амінокислот - тирозину ((-аміно-

(-оксіфенілпропіоновая кислота) і триптофану ((-аміно-(- індолілпропіоновая кислота), які встановлюють колориметрической реакцією з реактивом Фолина. Цим методом визначають зазначені амінокислоти як у вільному, так і в зв'язаному стані.

За кількістю тирозину і триптофану, що міститься в гідролізаті, визначають кількість перетвореного білка в процесі ферментативної реакції (з розрахунку вмісту в білку 6% тирозину і 1.8% триптофану). В основу розрахунку активності протеолітичних ферментів покладена залежність ступеня гідролізу білка від кількості одиниць активності ферменту, введених в ферментативну реакцію. На основі цієї залежності складається графік.

Оскільки в даному методі кількість амінокислот , що характеризують кількість що перетворювався білка, визначається за інтенсивністю забарвлення реакційних середовищ - оптичної щільності після реакції з реактивом, то у графіку для простоти розрахунку замість кількості перетвореного білка ставиться пропорційна йому оптична щільність розчину. При складанні графіка по осі абсцис відкладають число одиниць ферменту, введене в ферментативну реакцію, а по осі ординат - оптичну щільність, отриману після колориметрической реакції з реактивом

Фолина.

Вміст білка, мг Одиниці активності

Залежність оптичної щільності від кількості перетвореного в процесі ферментативної реакції білка.

Залежність оптичної щільності від числа одиниць активності протеолітичних ферментів.

Відносячи кількість введених в реакцію одиниць активності ферменту до дії 1 г препарату, визначають його активність. Для розрахунку прямої, зображеної на графіку, становить розрахункове рівняння.

За одиницю протеолітичної активності прийнято таку кількість ферменту, яке каталізує за 30 хвилин гідроліз 1 г білка в прийнятих умовах до продуктів, не обложників трихлороцтової кислотою. 1г становить 25% від взятого на ферментативну реакцію білка.

Протеолитическая активність характеризується числом одиниць активності ферменту, що міститься в 1 г препарату і твердих напівпродуктів або в 100 мл рідких матеріалів. Метод призначений для аналізу очищених ферментних препаратів грибного походження і всіх напівпродуктів, що виходять при їх виробництві.

Визначення пепсину по Ансону і Мирського. Даний метод заснований на наступних принципах. Гемоглобін піддають дії пепсину, що залишився гемоглобін беруть в облогу трихлороцтової кислотою. Фенольні властивості залишку (тирозин), що визначаються фотометричним, використовують як міру активності ферменту.

Субстратом служить 2%-ний розчин гемоглобіну в 0.06 н. розчині соляної кислоти, 5 мл субстрату нагрівають до 250С, додають 1 мл розчину ферменту, залишають на протязі 10 хв., додають 10 мл 0.3 н. розчину трихлороцтової кислоти, енергійно збовтують, фільтрують і 5 мл фільтрату відливають у мірну колбу на 25 мл. Сюди ж доливають 10 мл

0.5 н. розчину їдкого натру і 3 мл фенольного реактиву (реактив Фолина-

Чіокалтеу розводять попередньо подвійним об'ємом води) і доводять водою до мітки. Після закінчення декількох хвилин пофарбований розчин фотометрують щодо стандартного розчину, що містить 0.0008 мекв тирозину в

5 мл 0.2 н. розчину соляної кислоти (до розчину додають 0.5% формальдегіду як антисептик). Для виключення можливих помилок ставлять холостий досвід. Одиниці пепсину виражають у мілліеквівалентах тирозину (в межах від 6.10-4 до 11.10-4): одиниці пепсину = мілліеквіваленти тирозину х1.47.

Визначення протеолітичних ферментів по Муру і Штейна. Метод заснований на тому, що містять (-аміногрупу амінокислоти дають з нингидридом забарвлену похідну - дикетогидриндилидендикетогидриндамин, а також альдегід-амінокислоти і вуглекислоту.

Пофарбований продукт має характерний максимумом поглинання при

570 м (, а інтенсивність забарвлення залежить від кількості амінокислоти. З пролином і оксіпіроліном реакція протікає в іншому напрямку, а максимум поглинання одержуваного при цьому пофарбованого продукту розташований при 440 м (.

Інкубацію ферменту зручно проводити в мірних колбах по 5 мл, в яких змішують і врівноважують при постійній температурі на водяній бані всі компоненти за винятком ферменту. Після цього додають фермент, розчин змішують і беруть проби для дослідження. Для кінетичних вимірювань концентрацію ферменту бажано підібрати таким чином, щоб аліквотні частини можна було б брати кожні 5 хвилин.

Аліквотні частини проби, взяті відразу ж після додавання ферменту, а потім через відповідні інтервали, додають у фотометричні пробірки, що містять 2 мл реактиву нингидрида - це негайно обриває реакцію . Після цього суміш 20 хв. нагрівають на водяній бані; отримана забарвлення стійка мінімум 24 години. Середня помилка при аналізі повторних проб становить (2%. Після розведення кип'яченої суміші проби і нингидрида 10 мл суміші, що складається з рівних обсягів води і н.пропанола, інтенсивність забарвлення визначають на спектрофотометрі Колемана при 570 м (.

Для калібрування користуються постійними кількостями стандартних амінокислот, що містять реакційні компоненти. За допомогою калібрувальних кривих, побудованих окремо для кожної досліджуваної амінокислоти, вимірювання інтенсивності забарвлення (по відношенню до контрольної колбі) перераховують в миллимоли. При розподілі цих величин на миллимоли субстрату, використаного в процесі реакції, можна знайти відсоток гідролізу.

Побудова калібрувальної кривої виключає помилки, що відбуваються від якісних відмінностей реакції амінокислот на кольоровий реактив. До оптичної щільності 0.1 залежність між величиною поглинання і кількістю субстрату носить лінійний характер.

Відтворюваність становить (3%. Заважає вплив амонію, амінів та інших речовин, що містяться в біологічному матеріалі і дають кольорову реакцію з нингидридом, виключається за допомогою відповідних холостих проб. Аналіз порівняно спрощується, коли вивчають протеолітичні ферменти, субстратами яких є пептиди, що не містять вільних аміногруп. У цьому випадку вся утворюється забарвлення цілком припадає на звільнилася амінокислоту.

Мікрометод визначення активності протеїназ А.П.Алексеенко.

Пропонований мікрометод визначення активності протеолітичних ферментів заснований на вимірюванні вмісту аргініну в пептидах, що звільняються при гідролізі протеиназами білкових субстратів.

Зміст аргініну визначають за допомогою стабілізованої і вдосконаленою реакції Сакагучи (хроматограму занурюють в 0.1% розчин 8-гідроксихінолін в ацетоні, висушують на повітрі, обприскують розчином 0.2 мл Br2 в 100 мл 0.5 М NaOH; аргінін і інші гуанідинів дають оранжево-червоні плями, тауроміцін і гликоциамин - лише тимчасову забарвлення), що дозволяє визначити вміст аргініну в розчинах трихлороцтової кислоти після осадження і видалення нерозчинних білків.

Знаючи вміст аргініну в білковому субстраті і визначаючи його кількість в перейшли в розчин пептидах, можна розрахувати відсоток гідролізу білкового субстрату досліджуваними протеиназами. У цьому полягає головна перевага методу, оскільки метод Ансона не дає можливості розрахувати відсоток гідролізу білка, атакується протеолітичними ферментами. З усіх існуючих методів тільки метод Мура і Штейна дозволяє визначити відсоток гідролізу білкових субстратів, але він має обмежене застосування, оскільки вимагає попереднього проведення повного кислотного

Сторінки: 1 2 3 4

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар