Головна
Реферати » Реферати з біології » Визначення активності ферментів

Визначення активності ферментів

гідролізу як білка-субстрату, так і утворилися пептидів. У запропонованій методиці калібрувальна крива будується за розчинів вільного аргініну. Введення в реакцію пептидів і білків у вигляді їх біуретових комплексів підвищило чутливість реакції Сакагучи із залишками аргініну і зробило її такою ж чутливою, як і для вільного аргініну. В якості білкового субстрату використовують класичний субстрат - гемоглобін і окислений по Сангеру лізоцим. Цей низькомолекулярний білок, що містить 12.7% аргініну чудово розщеплюється пепсином (рветься близько 30 зв'язків).

Перш ніж приступити до визначення активності ферментів у досліджуваних тканинних субстратах, необхідно:

1. Визначити залежність активності від рН і вибрати оптимальну реакцію середовища для прояву активності досліджуваного ферменту.

2. Побудувати графік залежності активності ферменту від часу його інкубації з субстратом. вибрати для роботи ті терміни інкубації, при яких зберігається лінійна залежність між величиною активності ферменту і часом його інкубації.

3. Визначити залежність величини активності від концентрації білка в пробі. Вибрати такі концентрації ферменту, при яких величина активності ферменту була б пропорційна його концентрації. Слід враховувати, що в тканинних екстрактах і біологічних рідинах можуть бути присутніми інгібітори протеолітичних ферментів. При розведенні проби їх концентрація знижується, а протеолітичних - збільшується.

Визначаючи "фактор розведення", можна одночасно з підбором оптимальних умов для визначення протеолітичної активності виявити і наявність інгібітору.

4. При визначенні активності ферменту необхідно працювати при постійній швидкості ферментативної реакції, що досягається при повному насиченні ферменту субстратом, при так званій максимальної швидкості ферментативної реакції. У кожному окремому випадку максимальну швидкість необхідно знайти експериментально, вимірявши активність препарату при різних концентраціях субстрату, при постійних концентраціях білка і часу інкубування.

Визначення активності протеїназ по білкового субстрату.

До 0.5 мл субстрату у відповідному буферному розчині додають 0.5 мл проби, що містить фермент (екстракт, біологічну рідина), інкубують встановлене дослідним шляхом час, після чого білки в пробі осаджують 5 мл 10% трихлороцтової кислотою. Відокремлюють осад центрифугуванням, а надосадову рідину (ТХУ-центрифугат) піддають подальшій обробці.

Контрольні проби - проби, де реактив доданий у зворотному порядку: до 3 мл 10% розчину Тху додають 0.5 мл розчину, що містить фермент і 0.5 мл субстрату. Рекомендується ставити пробу на автолиз субстрату: до 0.5 мл субстрату додають 0.5 мл прокип'яченого розчину, що містить фермент, інкубують разом з досвідченими пробами і обложеної Тху.

Визначення вмісту аргініну в ТХУ-центрифуганта за модифікованою реакції Сакагучи. До 0.5 мл ТХУ-центрифуганта додають

0.5 мл 2.5мм розчину CuSO4, 0.5 мл 5 Н. КОН, 0.5 мл розчину ДХН (2,4 - дихлор-1-нафтол). Розчин струшують і вносять 0.5 мл гипобромита натрію, миттєво виникає яскраво-рожеве забарвлення. Розчин струшують і через 20-30 секунд стабілізують проби додаванням 0.2 мл розчину 2 - тіогліколят (щоб запобігти руйнуванню пофарбованого продукту надлишком гипобромита натрію. Після додавання 2-тіодігліколя в проби як досвідчені, так і контрольні, з'являється жовтувате фарбування за рахунок побічного продукту реакції між надлишкової ТХУ і гипобромита натрію.

Побічний продукт також стабілізується 2-тіодігліколя. Оптична щільність проби вимірюється спектрофотометром при 520 нм в кюветі товщиною 1 см.

Визначення активності протеїназ по реакції з реактивом Фолина. К

0.5 мл того ж Тху-центрифуганта додають 0.5 мл 2.5 мМ розчину CuSO4

, 4 мл 0.5 н. розчину NaOH і 1.5 мл розведеного в три рази реактиву

Фолина. Через 30 хвилин вимірюють на спектрофотометрі оптичну щільність при 760 нм

Калібрувальні криві по пепсіновое гідролізату окисленого лізоциму. 30 мг окисленого лізоциму розчиняють в 50 мл підкисленою води (40 мл Н2О + 10 мл 0.3 н. розчину HСl. і до отриманому розчину додають 0.5 мг пепсину. Суміш залишають при кімнатній температурі на добу. Після закінчення цього терміну інкубації препарат не дає осаду з ТХУ.

Цей препарат використовують поряд з розчинами аргініну і тирозину в якості стандарту для побудови калібрувальних кривих. Готують розведення з вмістом від 60 до 600 мкг / мл вихідного лізоциму. У проби вводять відповідне досвідченим пробам кількість Тху. Готують також розчини вільного аргініну і тирозину з концентраціями від 0.04 до 0.25 мкмоль / мл. З кожної проби беруть по 0.5 мл (у трьох паралельних пробах) для визначення вмісту аргініну і тирозину по Фолину.

Калібрувальні криві. 3 отримана за допомогою микрометода на основі реакції Сакагучи (520 нм) по розчинів аргініну (х) і по пептидного гідролізу лізоциму (о); 1 і 2 - за допомогою реакції Фолина (760 нм): 2 - по розчинів тирозину, 1 - по пептидного гідролізу лізоциму. Значення оптичної щільності проб, виміряні при 520 нм чи 760 нм, нанесені на графік проти концентрації аргініну або тирозину або їх залишків у пепсіновое гидролизате лізоциму. Крива 1, що проходить вище кривої 2, отримана при реакції реактиву Фолина з рас-

Кількість амінокислоти або її залишку в гідролізаті в наномолях на 1 мл. творами тирозину еквівалентної концентрації. Крива 3 отримана в результаті реакції Сакагучи як з вільним аргініном, так і з його залишками, що містяться в пептидах пепсинового гідролізату лізоциму.

Розташування досвідчених точок точно по прямій свідчить про те, що в гідролізаті, обложеному ТХУ, весь аргінін повністю реагує з реактивом Сакагучи.

Вплив Фолина на тирозин неспецифічно. Крім тирозину в пептидах з цим реактивом реагують триптофан, цистеїн. Утворені міддю з тетрапептид і поліпептидами біуретового комплекси полегшують таку взаємодію. Отже, вираження величини активності протеолітичних ферментів у тирозинових еквівалентах і по Фолину, як це іноді роблять, неправильно.

Таким чином, ми розглянули особливості ферментів як біологічних каталізаторів, показані їх відмінності від небілкових каталізаторів, способи вимірювання активності запропонованих ферментів - пепсину і папаїну. На жаль, на даний момент є досить незначна кількість публікацій з дослідження папаина.

Література


1. Березів Т.Т., Коровкін Б.Ф. Біологічна хімія: Підручник. - М.: Медицина,
1990. - С.115
2. Основи біохімії: Підручник для студ. біол. спец. ун-тов/под ред. А.А.
Анісімова. - М.: Вис.шк., 1986. - С.133-140
3. Ферштей Е. Структура і механізм дії ферментів. - М .: Світ., 1980. - с.
373-388
4. Кочетов Г.А. Практичний посібник з ензимології. - М., 1989
5. Діксон М., Уебб Е. Ферменти: пер.англ. - М.: Світ, 1982. - Т.1. - С. 370-375
6. Асатіані В.С. Біохімічна фотометрія. - М.: Изд. АН СРСР, 1957. - С.248-
253


Сторінки: 1 2 3 4
 
Подібні реферати:
Білок - основа життя
Для видалення соляної кислоти в склянку додають 10 мл дистильованої води, перемішують і залишають ще на 5 хвилин. Рідина обережно зливають з осаду. До осаду ще раз додають 10 мл дистильованої води
Домашній аналіз води
Дуже рідко в акваріумний літературі можна зустріти в одному місці всі потрібні любителю відомості про хімічний аналіз води. У даній роботі - рецепти та методики визначення хімічного складу води.
Сорбційні властивості моху по відношенню до мікроорганізмів і важких металах
У скляні флакони поміщають навішування по 200 +0,5 мг моху, зважені на аналітичних вагах. Додають по 50 мл розчину металу 0,02 моль / л і ретельно перемішують. Через 5, 10, 20, 30, 60 і 120 хв мох отфіл
Роль білків в організмі. Ферменти
Білки - незамінний будівельний матеріал. Однією з найважливіших функцій білкових молекул є пластична. Усі клітинні мембрани містять білок, роль якого тут різноманітна. Кількість білка в мембран
Метод ідентифікації собак по їх ДНК
Ідентифікація організму (метод мікросателітів) спочатку була розроблена для людей, але ця ж сама методика може бути з успіхом використана і для собак.
Властивості й роль у біохімічних процесах амінокислот, що входять до складу бе ...
Амінокислоти - це клас органічних сполук, що містять одночасно карбоксильні і аміногрупи.
Біологічна роль гідролізу в процесах життєдіяльності організму
Гідроліз білків. Білкові речовини становлять величезний клас органічних, тобто вуглецевих, а саме вуглецево азотистих сполук, неминуче зустрічаються в кожному організмі. Роль білків в організмі ог
Області застосування протеаз
Основні області застосування протеаз. Застосування протеаз у легкій промисловості.
Властивості й роль у біохімічних процесах амінокислот, що входять до складу бе ...
Амінокислоти - це клас органічних сполук, що містять одночасно карбоксильні і аміногрупи. Зазвичай амінокислоти розчинні у воді і нерозчинні в органічних розчинника.
Сьогодення та майбутнє біосенсори
Відомо, що ферменти - це біологічні каталізатори, що володіють яскраво вираженою здатністю вибірково каталізувати багато хімічні перетворення як в живій клітині, так і поза організмом. Чудові
Ферменти
Відомо більше 20000 різних ферментів, з яких багато виділені з живих клітин та отримані в індивідуальному стані. Перший кристалічний фермент (уреаза) виділено американським біохіміком Д.Самнером в
Білок - основа життя
Програма спецкурсу "Білок - основа життя". 2.1. Пояснювальна записка. Запропонована програма спецкурсу "Білок - основа життя" призначена для учнів X-XI класів
Світіння супроводжує біологічні реакції
Енергійно протікають хімічні реакції супроводжуються, як правило, виділенням енергії в формі тепла; існують, однак такі реакції, які супроводжуються випромінюванням світла. Світіння, що супроводжує химич
Математичне моделювання біосинтезу продуктів метаболізму
Введення. МЕТАБОЛІЗМ - ??грецьке слово metabole, що означає зміна, перетворення.
Математичне моделювання біосинтезу продуктів метаболізму
У фізіологічному сенсі метаболізм - це проміжний обмін, тобто перетворення певних речовин усередині клітин з моменту їх надходження до утворення кінцевих продуктів ( напр., метаболізм білків, метабол
Білки
Білки - це високомолекулярні сполуки, молекули яких представлені двадцятьма альфа - амінокислотами, з'єднаними пептидними зв'язками - СО - NН-. Мономерами білків є амінокислоти. Хімічне стр
Вміст аскорбінової, дегідроаскорбінової і дикетогулоновая кислот в Ері ...
Метою даної роботи було визначення вмісту АК, ДАК, ДКГК в загальній еритроцитарної масі у дітей, які страждають на інсулінозалежний цукровий діабет. Дана робота являє собою частину досліджень, провід
Енергетичні речовини тканин нирки
НИРКИ - найважливіші парні органи виділення хребетних тварин і людини, беруть участь у водно-сольовому гомеостазі, тобто в підтримці сталості концентрації осмотично активних речовин в рідинах внутрішнього
Загальні шляхи обміну амінокислот. Шляхи знешкодження аміаку в організмі
Проміжний обмін амінокислот у тканинах. Орнітіновий цикл мочевінообразованія.
Загальні шляхи обміну амінокіслот.Путі знешкодження аміаку в організмі
Проміжний обмін амінокислот у тканинах. Проміжний метаболізм амінокислот білкових молекул, як і інших поживних речовин в організмі, включає катаболические (розпад до кінцевих продуктів) і анаболічні (біосинтез амінокислот) процеси, а також ряд інших специфічних перетворень, що супроводжуються утворенням біологічно активних речовин.