Головна
Реферати » Реферати по біології » Методи вимірювання іонних струмів

Методи вимірювання іонних струмів

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ

РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦІЇ

НИЖЕГОРОДСЬКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО ЧЕРВОНОГО ПРАПОРА

ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. Н.И.Лобачевский

БІОЛОГІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА БІОФІЗИКИ

Реферат на тему

Методи вимірювання іонних струмів

Виконав студент

4 курсу гр.144-7

Савін А.В.

Нижній Новгород

1998

1. Метод фіксації потенціалу

Для вивчення потенціалзавісімих мембранних каналів застосовується метод фіксації потенціалу. В даному методі використовують електронну систему зі зворотним зв'язком, яка забезпечує автоматичну підтримку мембранного потенціалу. Різниця потенціалів по різні сторони мембрани фіксують на певному рівні, при цьому мембранний потенціал можна східчасто змінять на строго певну величину. Такий метод дозволяє виміряти іонні струми, що протікають крізь мембрану через канали, які активуються при зміні потенціалу. Відповідно до закону Ома, якщо напруга на мембрані постійно, зміни струму однозначно пов'язані із змінами провідності. В свою чергу, ми можемо фіксувати мембранний потенціал на різному рівні і вимірювати виникають при цьому струми. Якщо ж використовувати розчини з розрізненням іонним складом, і препарати, вибірково блокують той чи інший канал, то можна буде вивчати поведінку різних іонних каналів, через які протікають вимірювані нами струми. Технічно фіксація потенціалу здійснюється наступним чином. За допомогою підсилювача-регулятора внутрішньоклітинний потенціал порівнюють з керуючим потенціалом (див. Рис.1). Будь-яке відхилення мембранного потенціалу від керуючого посилюється і на виході підсилювача виникає керуючий струм. Цей струм тече через електроди, розташовані по різні сторони мембрани в такому напрямку, що мембранний потенціал знову стає рівним керуючому. Таке автоматичне узгодження відбувається за частку мілісекунди після того, як задається ступінчастий керуючий потенціал.

Коли у відповідь на таку ступінчасту деполяризацию відкриваються натрієві
(або будь-які інші) канали, відповідні іони входять в аксон по електрохімічного градієнту і переносять з собою електричні заряди . Ці вхідні заряди прагнуть зрушити мембранний потенціал в позитивному напрямку, проте найменше відхилення від керуючого потенціалу негайно компенсується в результаті видалення з клітин надлишкових зарядів за допомогою підсилювача-регулятора. При цьому записується той струм, який подається підсилювачем для підтримки мембранного потенціалу на необхідному рівні, і цей струм в точності дорівнює ионному струму, що протікає через мембрану.
Метод фіксації напруги, або кламп метод, дозволяє вимірювати іонний потік при переміщенні іона по контрольованому градієнту електрохімічного потенціалу і отримувати інформацію про електричну провідності мембрани і її пасивної проникності щодо даного нас іона. Цей метод використовується для вимірювання вольт- амперних характеристик рослинних клітин, що дозволяє отримати інформацію про тонкі механізми функціонування різних систем мембранного транспорту.

2. Метод Петч-кламп

Метод Петч-кламп (patch-clamp) дозволяє здійснювати локальну
(точкову) фіксацію мембранного потенціалу і вимірювати струми через одиночні іонні канали. На даний момент цей метод є потужним засобом для дослідження біомембран. Метод дозволяє:
1. проводити багато досліджень в рамках класичних електрофізіологічних підходів.
2. реєструвати струми і потенціали від клітин дуже малих розмірів (3-10 мкм)
3. реєструвати струми одиночних каналів амплітудою порядку пікоампер
4. дослідити дію лікарських препаратів при швидкому підведенні їх як до зовнішньої, так і до внутрішньої сторони мембрани

Метод Петч-кламп був введений в дослідну практику Неєра і
Сакманом, коли в 1976 році ними було опубліковано статтю в журналі
"Nature", яка називалася "Токи через поодинокі канали в мембрані волокна денервированной м'язи жаби". Це відкрило шлях для вивчення на молекулярному рівні електричних властивостей мембран і регуляції різних транспортних процесів.

Основою для створення методу послужило виявлення факту, що при певних умовах клітинна мембрана формує дуже щільний контакт з поверхнею кінчика скляного мікроелектрода. При невеликому розрідженні, створюваному всередині піпетки, між склом і мембранним фрагментом виникає контакт, що має гігаомное опір. В результаті утворюється електрично ізольований ділянку мембрани, і шум реєструючого сигналу зменшується на кілька порядків. Так як контакт мембрани зі склом дуже міцний, то що знаходиться під кінчиком електрода фрагмент треба або ізолювати від клітини, або зруйнувати, і таким чином проникнути всередину клітини. Існує кілька варіантів методу Петч-кламп (рис.2).


Найбільш близьким до природних умов є варіант вимірювання іонних струмів на прикріпленою, але неушкодженої (cell-attached) клітці, оскільки досліджуваний ділянку г99земембрани не відділяється від клітини і не порушується його зв'язок з цитоплазмою. Вимірювання на цілій клітині при руйнуванні мембрани в кінчику микропипетки (whole-cell) дозволяє замінювати іонний склад цитоплазми і вивчати на диализированном таким чином клітинах іонні струми в режимі фіксації напруги.

Йонні струми через невеликі мембранні фрагменти вимірюють за допомогою піпеток, у яких діаметр кінчика дорівнює розмірам фрагментів.
Опір піпеток, заповнених розчином 150 ммоль / л KCl і занурених у розчин такої ж концентрації, приблизно лінійно залежить від площі отвору кінчика і варіює від 1 до 5 МОм. Площа отвори кінчика піпетки можна варіювати від 1 до 8 мкм2, змінюючи ступінь нагрівання спіралі на останньому етапі витягування. Ці розміри знаходяться на межі дозволу світлового мікроскопа. Зовнішню поверхню покривають гідрофобним матеріалом
- сілгардовой гумою. Особливістю незастившего сілгарда є його здатність розтікатися тонкою плівкою по поверхні скла на кілька міліметрів, покриваючи при цьому і кінчик мікроелектрода. Так як високоомні контакти утворюються тільки з чистим склом, цю плівку необхідно видаляти тільки оплавленням мікроелектродів. При роботі на мембранних фрагментах використовується кілька типів піпеток.
Піпетки з тугоплавкого скла отримали у практиці більше застосування, ніж піпетки з м'якого скла. Перші мають більше питомий опір, ніж м'яке скло з більш низькою температурою плавлення. Внаслідок цього вклад шуму, обумовленого ємністю зв'язку через скляну стінку в піпетках з тугоплавким склом менше.

Піпетки з товстостінного тугоплавкого скла мають ряд переваг. По-перше, при більшій товщині стінок шунтирующая провідність через скло менше. По-друге, на деяких препаратах гігаомние контакти більш стабільні і величина їх утворення значно більше, ніж для аналогічних

тонкостінних піпеток

Табл.1. Геометричні параметри

кінчиків піпеток, що виготовляються із різних типів ст. капілярів

| Матеріал, з якого | Площа | Площа | Ширина | Кут |
| виготовлені піпетки | отверсти | кільця, | кільця, | конуса, |
| | ямкм2 | мкм2 | | |
| | | | мкм | град |
| Тонкостінні | 1.0 | 0,79 | 0,19 | 24 |
| капіляри CEE BEE - | | | | |
| м'яке скло | | | | |
| Кімакс - тверде | 1,2 | 0,82 | 0,2 | 20 |
| боросиликатное скло | | | | |
| Алюмінієве - тверде | 1,0 | 0,9 | 0,22 | 25 |
| алюмосилікатні | | | | |
| скло | | | | |
| Тонкостінні | 1,01 | 1,71 | 0,39 | 10 |
| капіляри Jencons - | | | | |
| тверде | | | | |
| боросиликатное скло | | | | |

Мембранні фрагменти


При роботі з деякими клітинами, наприклад, з ізольованими за допомогою ферментів клітинами міокарда, гігаомние контакти іноді формуються спонтанно, при дотику кінчиком піпетки до поверхні клітки високоомний контакт формується без подсасиванія. В цьому випадку не спостерігається ніяких деформацій клітинних мембрани, і площа мембранного фрагмента можна оцінити за значенням опору піпетки до освіти контакту. Але в більшості випадків контакт формується тільки при невеликому розрідженні, створюваному всередині піпетки. При цьому поверхня мембрани деформується, частина її втягується всередину піпетки на 2-3 мкм, приймаючи Q-подібну форму. Коли фрагмент ізолюють механічним відведенням кінчика піпетки від поверхні клітини, його У-образна форма практично не змінюється. При подальшому подсасиваніе утворюється сферичний бульбашку.
Якщо відома питома ємкість мембрани (як правило, вона становить 1 мкф / см2), площа фрагмента можна оцінити за величиною його ємності; зазвичай площа варіює від 2 до 25 мкм2.

Електронні схеми для Петч-кламп реєстрації

Електронна схема Петч-кламп реєстрації повинна мати такі параметри, щоб було можливим зареєструвати пересування всього лише декількох сотень елементарних електричних зарядів через малий ділянка клітинної мембрани. При максимально знижених власних шумах вимірювальної апаратури, струми через одиночні Електровозбудімость Са-канали, можна зареєструвати тільки в нефизиологических умовах - наприклад, при використанні розчинів, що містять Ва2 + замість Са2 +.

Стандартним методом вимірювання малих струмів є реєстрація створюваного ними падіння напруги на високоомному опорі. На рис.3 представлений три електричні ланцюги, за допомогою яких здійснюються подібні вимірювання. Найбільш зручно автоматичне підтримання необхідного значення Vб за допомогою операційного підсилювача, який являє собою керований потенціалом джерело напруги (рис.3, в).

Реєстрація від цілої клітини в умовах щільного контакту

Незважаючи на те, що метод Петч-кламп був розроблений для реєстрації струмів через поодинокі канали, Петч-піпетки можна з успіхом використовувати також для реєстрації струмів від цілої клітини (РЦК), особливо коли розміри її невеликі. Після утворення гігаомного контакту мембранний фрагмент під піпеткою можна зруйнувати, прикладаючи до неї короткі імпульси негативного тиску. Така маніпуляція в більшості випадків не порушує контакту піпетки з мембраною, і в результаті між піпеткою та вмістом клітини встановлюється добре ізольований від омиває розчину проводить шлях. Такий спосіб проникнення в клітину завдає їй набагато менше пошкоджень, ніж введення стандартного мікроелектрода.
Вхідний опір невеликих клітин велике в порівнянні з ефективним опором кінчика піпетки, тому при роботі з ними електричні вимірювання можна проводити від ділянки мембрани набагато більшої площі, ніж у вихідного фрагмента. На відміну від різних варіантів ПК реєстрації цей метод

Сторінки: 1 2