Реферати » Реферати по біології » Рекомбінантні вакцини (Генна інженерія)

Рекомбінантні вакцини (Генна інженерія)

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение.......................................................................................................3
1. Принципи конструювання рекомбінантних противірусних вакцин ............ ..4-24

1. Отримання відповідного фрагмента нуклеїнової кислоти ............... .... ... .4

2. Вибір високоактивної і добре вивченою в імунологічному отно-

шеніі моделі вектора-носія і клонування відповідного гена ...... 9-21

1. Отримання рекомбінантних ДНК ................................................... 9

2. Отримання рекомбінантних РНК ........................ ........................ ... 11

3. Стратегія клонування генів ................................................. ... +13

4. Різноманітність векторних молекул ................................................ 17

3. Вибір системи експресії клонованого гена, здатної забезпечити максимальний вихід і функціональну повноцінність продукту ............... ..22

4. Створення досить зручних і по можливості універсальних векторів для цільової доставки генів у клітини і тканини організму .............................. 23
2. Вакцина проти лейкемії кішок, виготовлена ??за допомогою генної инженерии..............................................................................................24
Список литературы........................................................................................26

ВСТУП

Існуючі традиційні вакцини, незважаючи на очевидний позитивний ефект їх широкого застосування, мають ряд недоліків. До них відносяться: наявність небажаних біологічно активних і баластних компонентів в препаратах, неповноцінні імунологічні властивості самих антигенів. Крім того, існують захворювання, які не викликають імунітету, вакцини проти яких взагалі відсутні і не можуть бути сконструйовані на основі класичних принципів. Все це викликає необхідність удосконалення вже існуючих вакцин і створення принципово нових типів вакцин. Одним з найбільш перспективних напрямків в даній області є отримання вакцинних препаратів на основі методів генної інженерії.

Останнім досягненням генної інженерії і біотехнології стало створення рекомбінантних противірусних вакцин, що містять гібридні молекули нуклеїнових кислот. Дані вакцини мають цілу низку переваг. Вони характеризуються відсутністю (або значним зниженням) баластних компонентів, повної нешкідливістю, низькою вартістю, яка пов'язана зі здешевленням промислового виробництва вакцин. Експрессіруемий в клітинах вакцинованого тваринного білок має конформацію, близьку до нативної, і має високу антигенної активністю.

Таким чином, рекомбінантні противірусні вакцини є новітнім поколінням вакцин. Їх очевидна перевага обумовлює широке застосування даного типу вакцин в медицині та ветеринарії для вакцинації населення та сільськогосподарських тварин.

1. ПРИНЦИПИ КОНСТРУЮВАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ

противірусні ВАКЦИН

Важливою умовою отримання ефективного вакцинного препарату є дотримання основних принципів його виробництва. Конструювання рекомбінантних противірусних вакцин передбачає: 1) одержання відповідного фрагмента нуклеїнової кислоти; 2) вибір високоактивної і добре вивченою в імунологічному відношенні моделі вектора-носія і клонування відповідного гена (або генів); 3) вибір системи експресії клонованого гена, здатної забезпечити максимальний вихід і функціональну повноцінність продукту; 4) створення досить зручних і по можливості універсальних векторів для цільової доставки генів у клітини і тканини організму.

1.1. ОТРИМАННЯ відповідний фрагмент

нуклеїнових кислот

Для конструювання рекомбінантних РНК або ДНК необхідно отримати фрагмент нуклеїнової кислоти, який в подальшому і буде вбудовуватися в векторну молекулу.

Фрагменти ДНК для вбудовування в вектор можна отримати безпосередньо з хромосомної ДНК, розщепивши її рестриктазами або зруйнувавши випадковим чином (наприклад, за допомогою ультразвуку) на сегменти з приблизно однаковою довжиною. Виділення генів за допомогою "вирізування" з генома, як правило, складається з чотирьох етапів: 1) одержання клонотекі фрагментів геному; 2) виявлення фрагментів геному, що містять необхідний ген, і точна локалізація гена в даному фрагменті; 3) вирізання гена з фрагмента (ів) за допомогою рестриктаз і зшивання ділянок гена за допомогою ДНК-лігази фага Т4, якщо ці ділянки отримані з різних фрагментів; 4) ампліфікація гена у складі векторної молекули. Зазначений спосіб отримання генів є найбільш прийнятними стосовно до протозойних збудникам, бактеріям і для деяких складно влаштованих ДНК-вірусів. Такі операції проводяться, зокрема, при створенні так званих "бібліотек генів", тобто набору однакових векторних систем, в сукупності що несуть в собі весь геном даного організму. Однак цей підхід має ряд істотних недоліків. По-перше, дуже складна задача підбору рестриктаз, що дозволяють вирізати з геномної ДНК або клонованого фрагмента генома цільний ген.
Як правило, разом з геном залишаються фланкирующие його зайві нуклеотидні послідовності, що заважає подальшому використанню цього гена, або ж рестріктази відрізають частину гена, роблячи його функціонально неповноцінним. По-друге, створення клонотекі генома збудника представляє спеціальну задачу і вимагає великих затрат часу. Нарешті, для ряду ДНК-вірусів (паповавіруси) доведений сплайсірованний характер структури генів.
Цілком зрозуміло, що виділені гени цих вірусів внаслідок наявності інтронних областей не будуть проявляти функціональної активності в бактеріальних клітинах і виявляться непридатними при вирішенні задач з конструювання рекомбінантних противірусних вакцин. По-третє, якщо ген складає незначну частку від усієї геномної ДНК, то виникають великі труднощі з його ізоляцією і ідентифікацією.

Найбільш поширеним є шлях отримання генів через синтез
ДНК-копій (кДНК) інформаційних або будь-яких інших (в оптимальному випадку
- індивідуальних) РНК шляхом їх зворотної транскрипції. Даний спосіб включає в себе три етапи: 1) виділення високоочищених мРНК, що кодують структурні білки, або виділення геномних РНК вірусів; 2) синтез двухцепочечной ДНК (гена) на матрицях РНК; 3) ампліфікація гена за допомогою методів молекулярного клонування.

Як зазначалося, першим етапом в отриманні генів за допомогою методів зворотної транскрипції служить виділення і очистка геномних РНК і мРНК.
Геномні РНК виділяють головним чином з очищених віріонів, а мРНК - з інфікованих клітин. Для виділення мРНК з інфікованих клітин використовують різні способи. В одному з варіантів виділення мРНК з інфікованих клітин проводять безпосередньо з лу клітин
(лізис здійснюють у денатуруючих середовищах в цілях запобігання руйнівної дії нуклеаз на мРНК) з подальшою екстракцією фенолом і хлороформом або центріфігурірованіем лизата через подушку 5 , 7M СsCl (для звільнення від клітинних ДНК) і заключної аффинной хроматографією на оліго (dТ)-целлюлозе (поли (У)-сефарозе). Виділення мРНК можна проводити і з очищених полірібосом інфікованих клітин.

В разі необхідності отримання специфічних мРНК, які кодують структурні білки збудника, використовують наступний спосіб.
Інфіковані вірусом клітини руйнують механічним шляхом або хімічними методами (використання неіонних детергентів). Клітинний лизат звільняють від ядер і мітохондрій методом диференціального центрифугування і піддають хроматографії на антитільної сорбенте. При цій процедурі з антитілами, специфічними до певного структурному білку збудника, зв'язуються полісоми, що здійснюють синтез цього білка. Також може бути використаний метод непрямої иммунопреципитации полісом, при якому комплекс антитіло - полісома преципитирующих з розчину додаванням другого антитіла, специфічного до першого. В якості другого антитіла найчастіше беруть фіксовані формаліном клітини Staphilococcus aureus, на поверхні яких знаходиться так званий білок А, що має спорідненість до Fc-фрагментами
Ig. З полісом, отриманих одним з описаних способів, далі вже виділяють мРНК.

Інший шлях виділення індивідуальних мРНК базується на властивості мРНК взаємодіяти з комплементарними ДНК, пов'язаними з твердим носієм
(целюлоза, сефароза, нітроцелюлозні фільтри). Цей метод відбору та очищення специфічних мРНК є найефективнішим. Однак його застосування можливе лише за наявності відповідних комплементарних ДНК.

Отримання препарату очищеної мРНК дозволяє перейти до робіт по синтезу гена за допомогою зворотної транскрипції, яку здійснюють за допомогою ревертази AMV у спеціально підібраних умовах. В процесі зворотної транскрипції матрицею служить мРНК, а затравкой оліго (dT12-18) (для мРНК, що мають полі (А)-тракт) або хімічно синтезований олигонуклеотид, комплементарний 3'-концу мРНК. Після синтезу на мРНК комплементарної ланцюга
ДНК і руйнування РНК (частіше використовується обробка лугом) здійснюють синтез другого ланцюга ДНК. У цій реакції матрицею служить перший ланцюг ДНК.
Реакція може каталізувати як ревертазой, так і ДНК-полімеразою.

Після отримання двухцепочечной кДНК слід стадія отримання гена, яка полягає в гідролізі одноланцюжкові ділянки ДНК, що з'єднує першу і другу ланцюга, нуклеазами S1.

Для отримання необхідних ділянок РНК використовують дві групи способів:
1) розщеплення полірібонуклеотідной ланцюга РНК в заданому місці; 2) синтез
РНК (ферментативний на ДНК-або РНК-матрицях і хімічний).

Розщеплення полірібонуклеотідной ланцюга РНК може здійснюватися в присутності різних ферментів. Для цієї мети використовують ферменти: рибонуклеазу H, нуклеази, ковалентно пов'язані з олігонуклеотидами
(наприклад, стафілококова нуклеаза), рібозіми (наприклад, рибозим L-19).

Історично першим способом спрямованої ферментативної фрагментації
РНК (званої також адресованої, сайт-спрямованої або сайт-специфічної фрагментацією РНК) є розроблений в Московському університеті метод гідролізу РНК ферментом РНКази H в присутності комплементарних олігодезоксірібонуклеотідов. Цей метод до цих пір залишається найбільш універсальним способом спрямованої фрагментації РНК.

Метод заснований на властивості РНКази Н розщеплювати полірібонуклеотідной ланцюг РНК у складі ДНК-РНК-гетеродуплекса. До ділянки РНК, за яким планується провести її фрагментацію, синтезується комплементарний олігодезоксірібонуклеотіди довжиною в 6-10 нуклеотидних залишків. Далі отримують комплекс цього олигонуклеотида з РНК, який потім обробляють ферментом. У роботі зазвичай використовують РНКаз Н з Escherichia coli - цілком доступний фермент, який може бути досить легко очищений від всіх супутніх нуклеазного домішок. Цей метод знайшов досить широке застосування для сайт-специфічного розщеплення вірусних і рибосомних РНК, а також для ідентифікації продуктів процесингу деяких РНК.

Важливим достоїнством розглянутого методу є й те, що в результаті гідролізу РНК рібонуклеазою Н утворюються фрагменти, в одного з яких на 5'-кінці міститься фосфатна група, а в іншого 3'-кінець вільний (нефосфорілірован ). Такі фрагменти можна прямо використовувати в реакції ферментативного лигирования.

Серйозним обмеженням цього методу є те, що ділянка РНК, з яким зв'язується комплементарний йому олігодезоксірібонуклеотіди, повинен мати однотяжевую конформацию і перебувати на поверхні макромолекули
РНК, що представляє собою в умовах розщеплення компактну глобулу з розвиненою вторинної структурою. В окремих випадках це обмеження вдається перебороти, використовуючи досить довгі олігодезоксірібонуклеотіди (15-20-членниє), які попередньо отжигают з частково або повністю денатурированной РНК.

Інше обмеження

Сторінки: 1 2 3 4 5

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар