Головна
Реферати » Реферати по біології » Рекомбінантні вакцини (Генна інженерія)

Рекомбінантні вакцини (Генна інженерія)

можуть рости в присутності тільки одного з антибіотиків.

Інший дуже поширений приклад пов'язаний з наявністю в векторної
ДНК поряд з генами, що повідомляють клітці стійкість до антибіотиків, фрагмента лактозного оперону, що забезпечує освіту в клітинах-реципієнтах активного ферменту (-галактозідази. Колонії клітин з такою ознакою легко виявляються при вирощуванні їх на твердому агарі, що містить як субстрату (-галактозідази 5-бром-4-хлор-3-індоліл - (-галактозид (X-gal), оскільки його розщеплення призводить до утворення бромхлоріндола - барвника, пофарбованого в блакитний колір. Якщо ж в ген (-галактозидази цього вектора вбудована чужорідна ДНК таким чином, що цей ген виявився порушеним, то трансформовані їм клітини будуть утворювати безбарвні колонії. Саме ж присутність рекомбінантного вектора в клітинах може бути зафіксовано по їх стійкості до антибіотика.

На наступному етапі серед популяції клітин з рекомбінантними векторами необхідно відібрати індивідуальні клони, що містять тільки цікавлять нас гени або їх фрагменти. Само собою зрозуміло, що це в принципі можливо тільки в тому випадку, якщо в вихідні клітини проникло в середньому по одній молекулі рекомбінантної ДНК. Спосіб же відбору клонів в значній мірі залежить від природи клонують гена.

Мабуть, найпростішим є випадок, коли клонируемого ген здатний комплементіровать ауксотрофності мутацію в штамі-реципієнті. В цьому випадку клітини висіваються на середу, позбавлену речовини, необхідної для зростання даного штаму, і тільки клітини, що містять рекомбінантний ДНК з потрібним геном, здатні рости на цьому середовищі. З таких клонів отримують гомогенну культуру клітин, яку використовують для отримання шуканого сегмента ДНК, проробляючи всі операції в зворотному порядку (тобто з клітин виділяють вектор, з нього виокремлює необхідний фрагмент ДНК і так далі).

Набагато частіше для відбору необхідних клонів доводиться вдаватися до методу ДНК-ДНК-або ДНК-РНК-гібридизації. Для цього необхідно розташовувати
"зондами" (індивідуальними молекулами ДНК або РНК або їх фрагментами), комплементарними нуклеотидноїпослідовності клонують гена. Це можуть бути спеціально синтезовані олігодезоксірібонуклеотіди довжиною в
15-20 залишків, послідовність яких обрана на підставі повністю або частково відомої первинної структури гена або закодованого в ньому білка. Це можуть бути кДНК, синтезовані на індивідуальних РНК-копіях даного гена (як такі або у вигляді отклонірованних, тобто істотно помножених в кількості фрагментів ДНК). Нарешті, це можуть бути самі індивідуальні РНК, закодовані в даному гені. Ясно, що в усіх випадках
"зонди" повинні нести радіоактивну мітку (зазвичай 32Р) з досить високою питомою активністю.

Якщо ж індивідуальний "зонд" недоступний, то застосовують методи, які з великого числа рекомбінантов (106) дозволяють вибрати порівняно невелику групу (близько 102), що включає рекомбінант з потрібним геном. Ця група підрозділяється на підгрупи (наприклад, на 10) по 10 рекомбінантов.
З кожної підгрупи виділяється ДНК, яку використовують для синтезу мРНК і подальшої трансляції її з метою виявлення відповідного продукту шуканого гена.

Трансляція мРНК може бути здійснена в безклітинній системі. Однак у випадку еукаріотичних генів мРНК часто переносять в ооцити жаби
(ксенопуса) за допомогою техніки мікроін'єкції, де вона транслюється. Продукт трансляції зазвичай виявляють за допомогою антитіл.

Далі в підгрупі, де виявлено шуканий ген, тим же методом досліджується кожен клон.

При наявності зонда з чашки Петрі, на якій вирощені колонії клітин, робиться відбиток (репліка) на нітроцелюлозні фільтрі. Клітинам дають вирости на фільтрі, потім їх руйнують, піддають ДНК лужної денатурації і фільтр прогрівають при 80 ° С, після чого ДНК необоротно з ним зв'язується.
Фільтр відмивають від домішок і обробляють радіоактивним "зондом" в умовах, оптимальних для ДНК-ДНК-або ДНК-РНК-гібридизації. Після видалення надлишку "зонда" методом ауторадіографії визначають положення клітинного клона, що містить ділянку ДНК з нуклеотидної послідовністю, комплементарної "зонду". Цей клон стає потім джерелом клітин для отримання шуканого гена або його фрагмента.

Для селекції клонів, несучих необхідний ген, досить широко застосовуються і імунологічні методи. Принцип відбору на перших етапах той же, що і при використанні ДНК-і РНК-зондів. Далі з колоній з рекомбінантними ДНК робиться репліка за допомогою полімерної платівки, на якій закріплені антитіла до продукту шуканого гена. Положення клонів, виробляють цей білок, визначається також за допомогою антитіл, але вже мічених радіоактивним йодом (125I).

1.2.4. РІЗНОМАНІТНІСТЬ векторна МОЛЕКУЛ

Під поняттям "вектор" розуміється молекула нуклеїнової кислоти, здатна після введення в клітку до автономного існування за рахунок наявності в ній сигналів реплікації і транскрипції.

Векторні молекули повинні мати такими властивостями:

1) здатністю автономно реплицироваться в клстке-реципієнті, тобто бути самостійним репліконом;

2) містити один або кілька маркерних генів, завдяки експресії яких у клітини-реципієнта з'являються нові ознаки, що дозволяють відрізнити трансформовані клітини від вихідних;

3) містити по одному або, найбільше, по дві ділянки (сайту) для різних рестриктаз в різних районах (у тому числі в складі маркерних генів), але не в області, відповідальної за їх реплікацію .

Залежно від цілей експерименту вектори можна умовно розділити на дві групи: 1) використовувані для клонування та ампліфікації потрібного гена;
2) спеціалізовані, застосовувані для експресії вбудованих чужорідних генів. Друга група векторів об'єднує вектори, покликані забезпечити синтез білкових продуктів клонованих генів. Вектори для експресії містять послідовності ДНК, які необхідні для транскрипції клонованих копій генів і трансляції їх мРНК в штамах клітин.

В якості прокариотических векторів використовуються плазміди, бактеріофаги; в якості еукаріотичних векторів застосовують віруси тварин і рослин, вектори на основі 2 мкм дріжджів і мітохондрій і ряд штучно сконструйованих векторів, здатних реплицироваться як в бактеріальних, так і в еукаріотичних клітинах (човникові вектори).

Плазміди - це позахромосомних генетичні елементи про-і еукаріот, які автономно реплікуються в клітинах. Більшість плазмідних векторів отримано на основі природних плазмід ColE1, pMB1 і p15A.

Бактеріальні плазміди ділять на два класи. Одні плазміди (наприклад, добре вивчений фактор F, що визначає стать у E.coli) самі здатні переходити з клітини в клітину, інші такою здатністю не володіють. По ряду причин, і насамперед для запобігання неконтрольованого розповсюдження потенційно небезпечного генетичного матеріалу, переважна більшість бактеріальних плазмідних векторів створено на базі плазмид другого класу. Багато природних плазміди вже містять гени, що визначають стійкість клітин до антибіотиків (продукти цих генів - ферменти, модифікують або розщеплюють антибіотичні речовини). Крім того, в ці плазміди при конструюванні векторів вводяться додаткові гени, що визначають стійкість до інших антибіотиків.

На рис. 4 показаний один з найпоширеніших плазмідних векторів
E.coli - pBR322. Він сконструйований на базі детально вивченої плазміди
E.coli - коліціногенного фактора ColE1 - і містить Оріджін реплікації цієї плазміди. Особливість плазміди ColE1 (і pBR322 відповідно) полягає в тому, що в присутності інгібітора синтезу білка антибіотика хлорамфеніколу
(опосередковано ингибирующего реплікацію хазяйської хромосоми) її число в
E. coli зростає від 20-50 до 1000 молекул на клітину, що дозволяє отримувати великі кількості клонують гена. При конструюванні вектора pBR322 з вихідних плазмід був делегований цілий ряд "зайвих" сайтів для рестриктаз.

В даний час поряд з безліччю зручних векторних систем для
E.coli сконструйовані плазмідні вектори для ряду інших грамнегативних бактерій (в тому числі таких промислово важливих, як Pseudomonas, Rhizobium і Azotobacter), грампозитивних бактерій (Bacillus), нижчих грибів
(дріжджі) і рослин.

Плазмідні вектори зручні для клонування відносно невеликих фрагментів (до 10 тис. Пар основ) геномів невеликих розмірів. Якщо ж потрібно отримати клонотекі (або бібліотеку) генів вищих рослин і тварин, загальна довжина геному яких досягає величезних розмірів, то звичайні плазмідні вектори для цих цілей непридатні. Проблему створення бібліотек генів для вищих еукаріот вдалося вирішити з використанням як клонирующих векторів похідних бактеріофага (.

Серед фагових векторів найбільш зручні системи були створені на базі геномів бактеріофагів (і М13 E.coli. ДНК цих фагів містить протяжні області, які можна делегувати або замінити на чужорідну ДНК, не зачіпаючи їх здатності реплицироваться в клітинах E.coli. При конструюванні сімейства векторів на базі ДНК (фага з неї спочатку (шляхом поділів коротких ділянок ДНК) було видалено багато сайти рестрикції з області , не суттєвою для реплікації ДНК, і залишені такі сайти в області, призначеної для вбудовування чужорідної ДНК. В цю ж область часто вбудовують маркерні гени, що дозволяють відрізнити рекомбінантний ДНК від вихідного вектора. Такі вектори широко використовуються для отримання
"бібліотек генів". Розміри замещаемого фрагмента фаговой ДНК і відповідно встраиваемого ділянки чужорідної ДНК обмежені 15-17 тис. нуклеотидних залишків, так як рекомбінантний фаго-

Малюнок 4. Детальна рестрикционная карта плазміди pBR322.

Вий геном, який на 10% більше або на 75% менше генома дикого (фага, вже не може бути упакований в фагів частинки.

Таких обмежень теоретично не існує для векторів, сконструйованих на базі нитчастих бактеріофага М13. Описані випадки, коли в геном цього фага була вбудована чужорідна ДНК довжиною близько 40 тис. нуклеотидних залишків. Відомо, однак, що фаг М13 стає нестабільним, коли довжина чужорідної ДНК перевищує 5 тис. нуклеотидних залишків . Фактично ж вектори, отримані з ДНК фага М13, використовуються головним чином для секвенування і мутагенезу генів, і розміри вбудовуваних в

Сторінки: 1 2 3 4 5