Головна
Реферати » Реферати по біології » Рекомбінантні вакцини (Генна інженерія)

Рекомбінантні вакцини (Генна інженерія)

них фрагментів набагато менше.

Ці вектори конструюються з реплекатівной (двутяжевой) форми ДНК фага М13, в яку вбудовані "полілінкерние" ділянки (приклад такої конструкції показаний на рис. 5). В фагів частку ДНК включається у вигляді однотяжевой молекули. Таким чином, цей вектор дозволяє отримувати клонований ген або його фрагмент як в двутяжевой, так і в однотяжевой формі. Однотяжевие форми рекомбінантних ДНК широко використовуються в даний час при визначенні нуклеотидної послідовності ДНК методом Сенгера і для олігодезоксінуклеотід-спрямованого мутагенезу генів.

Перенесення чужорідних генів у клітини тварин здійснюється за допомогою векторів, отриманих з ДНК ряду добре вивчених вірусів тварин - SV40, деяких аденовірусів, вірусу папіломи бика, вірусу віспи і так далі.
Конструювання цих векторів проводиться за стандартною схемою: видалення
"зайвих" сайтів для рестриктаз, введення маркерних генів в області ДНК, які не істотні для її реплікації (наприклад, гена тимідин-кінази (tk) з HSV
(вірусу герпесу)), запровадження регуляторних районів, що підвищують рівень експресії генів.

Зручними виявилися так звані "човникові вектори", здатні реплицироваться як в клітинах тварин, так і в клітинах бактерій. Їх отримують, зшиваючи один з одним великі сегменти векторів тварин і бактерій (наприклад, SV40 і pBR322) так, щоб райони, відповідальні за реплікацію ДНК, залишилися незачепленими. Це дозволяє проводити основні операції з конструювання вектора в бактеріальної клітці (що технічно набагато простіше), а потім отриману рекомбінантний ДНК використовувати для клонування генів в тваринної клітині.

Малюнок 5 рестрикційний карта вектора М13 mp8.

1.3. ВИБІР СИСТЕМИ ЕКСПРЕСІЇ клонувати

ГЕНА, здатні забезпечити максимальний ВИХІД І

ФУНКЦІОНАЛЬНУ повноцінний продукт

Отримані рекомбінантні молекули переносяться в певні групи клітин, які повинні забезпечити експресію цих генів, тобто синтез відповідних білків в кількостях, економічно рентабельних порівняно із звичайною технологією їх виробництва.

Зазвичай для даної мети використовують бактеріальні або дріжджові культури клітин, а також системи експресії на основі еукаріотів.

З бактеріальних клітин найбільш вивченої в молекулярно-генетичному відношенні є грамнегативна бактерія Escherichia coli, тому для неї можна з найбільшою визначеністю планувати генноінженерні конструкції. Однак E. coli слабо освоєна промисловістю. Крім того, вона відноситься до умовно-патогенних для людини мікроорганізмів, що може створити труднощі при отриманні на її основі фармацевтичних препаратів.

Зазначені недоліки E. coli легко долаються при конструюванні методами генної інженерії штамів-продуцентів на основі клітин Bacillus subtilis. Дана грунтова бактерія безпечна для людини і тварин і прекрасно освоєна мікробіологічної промисловістю. Бактерія B. subtilis за ступенем вивченості слід за E. coli. Важлива відмінність її від E. coli - здатність ефективно секретировать в зовнішнє середовище цілий ряд білків, тому особливо цікаві роботи по створенню штамів-продуцентів B. subtilis, секретуючих чужорідні білки з клітин. Однак дана бактерія має свої недоліки: рекомбінантні плазміди в B. subtilis характеризуються нестабільністю, що виражається в перебудовах і делециях
ДНК; бацили секретують в культуральне середовище велику кількість протеаз, що істотно ускладнює питання максималізації генноїнженерного отримання цільового білка на основі бацил-продуцентів.

Серед еукаріотичних мікроорганізмів найбільш вивченим є нижчий еукаріот Saccharomyces cerevisiae. Одна з переваг S. cerevisiae як експериментальної системи - простота і надійність її генетичного аналізу. У клітинах дріжджів мається ферментативна система гликозилирования білків, яка забезпечує можливість синтезу в них повноцінних білків вищих еукаріот. Аналогічних систем процесингу білків в бактеріальних клітинах немає. Багато штами дріжджів освоєні мікробіологічної промисловістю. Доведено їх нешкідливість для людини і тварин. Саме на S. cerevisiae створений перший штам-продуцент поверхневого антигену вірусу гепатиту Б, що дозволив отримати і випробувати вакцину проти даного вірусного захворювання людини.

З появою генної інженерії увагу багатьох дослідників привернула система культивованих клітин тварин. Особливий інтерес до культур клітин тварин став проявлятися після виявлення того, що частина еукаріотичних генів роздроблена і лише в системі клітин вищих еукаріот можна досягти правильної експресії таких генів. Крім того, багато білки тварин і їх вірусів синтезуються спочатку у вигляді більш високомолекулярних попередників, які в результаті специфічного протеолітичного процесингу переходять у так звану зрілу форму. Такий процесинг даних білків, мабуть, можна чекати лише в системі клітин тварин.
Все це переконливо доводить важливість розробки експресує системи на основі клітин тварин.

Для забезпечення найбільш ефективної експресії клонованих генів в векторні молекули вбудовують певні фрагменти ДНК, що дозволяють збільшити вихід чужорідного білка. Так, для досягнення більш високого рівня експресії гена HBsAg в клітинах E. coli були використані різні за силою промотори (промотори генів cat, kan, bla, trp і тандемно розташованих промоторів генів kan і trp). Рівні синтезу послідовностей HВsAg (нативного і в складі химерних білків) становили в залежності від використовуваних конструкцій векторів від 100 до
100 000 молекул на клітину.

1.4. СТВОРЕННЯ ДОСИТЬ ЗРУЧНИХ І ПО МОЖЛИВОСТІ

УНІВЕРСАЛЬНИХ ВЕКТОРІВ ДЛЯ ЦІЛЬОВОЇ ДОСТАВКИ ГЕНОВ В

клітини і тканини ОРГАНИЗМА

Важливим моментом при конструюванні ДНК-вакцин є проблема цілеспрямованої доставки генів в необхідні клітини та захисту вводяться ДНК від дії нуклеаз крові. В результаті експериментальної роботи були створені різноманітні конструкції, що дозволяють доставляти цільові гени в клітини-мішені.

Однією з подібних конструкцій є модель молекулярного вектора для доставки генів в такі клітини, як лімфоцити і кераноціти. В якості модельного був використаний ген, який кодує гібридний білок: фактор некрозу пухлин-альфа - інтерферон-гамма. У центрі вектора знаходиться интактная плазмідна ДНК, що містить доставляється ген, а на поверхні розташовуються антитіла до клітин-мішеней. Кон'югат поліглюкіну зі спермідін і антитілами застосовується для зв'язку компонентів (позитивно заряджений спермидин забезпечує зв'язування кон'югату з плазмідної ДНК). Описаний молекулярний вектор дозволяє цілеспрямовано доставляти гени в клітини-мішені, зводячи до мінімуму їх потрапляння в інші види клітин, захищати доставляються гени від нуклеаз крові і використовувати позитивно заряджений комплекс спермидин-полиглюкин в якості стимулятора проникнення ДНК в клітини.

В даний час також створена векторна модель для доставки в клітини кісткового мозку гена, що кодує гранулоцитарнийколонієстимулюючий фактор людини (Чг-КСФ). Даний білок відноситься до сімейства гемопоетичних факторів росту і є одним з фізіологічних регуляторів, специфічно і високоефективно стимулюючих проліферацію і диференціювання гемопоетичних попередників нейтрофілів. Чг-КСФ збільшує тривалість життя клітин кісткового мозку, посилює функціональну активність зрілих нейтрофілів. Створений вектор являє собою багатошарову конструкцію. "Центральним ядром" конструкції є плазмида pGGF8, що містить ген Чг-КСФ. Її оточує полисахаридная оболонка, яка складається з поліглюкіну і спермидина. Зовнішній білковий шар містить суміш сироваткового альбуміну і білка доставки - трансферину.
Ефективність описаної векторної моделі було доведено досвідченим шляхом.

Отже, при конструюванні рекомбінантних противірусних вакцин немаловажне значення має створення спеціального вектора-носія, що забезпечує адресну доставку генів і їх захист від дії нуклеаз крові.

2. ВАКЦИНА ПРОТИ ЛЕЙКЕМІЇ КОТІВ,

виготовлені за допомогою генної інженерії

Збудником лейкемії кішок є ретровірус типу С. Вірус лейкемії кішок (FeLV) має в якості генетичного матеріалу молекулу РНК.
Захворюваність і смертність серед домашніх кішок в Швейцарії досить висока. Вакцина проти FeLV, виготовлена ??традиційним шляхом, була розроблена кілька років тому і знаходиться у продажу в Швейцарії.
Висока ціна сучасних вакцин і відсутність впевненості щодо тривалості ефекту і надійності вакцини викликали необхідність створення вакцини за допомогою генної інженерії.

При конструюванні рекомбінантних вакцини оболончатий протеїн вірусу
(env-ген) клонували в пивних дріжджах (Saccharomyces cerevisiae). Env-ген спочатку лігіровани з промотором дріжджів (піруваткіназний промотор), а потім клонували в так званому "Shuttle"-вектор. Вектор "Shuttle"
(човниковий вектор) може розмножуватися як в бактерії E. coli, так і в пивних дріжджах S. cerevisiae.Он містить з одного боку Реплікаційний ОРИГИН як для дріжджів, так і для E . coli, а з іншого боку селекційний маркер для дріжджів (leu2 ген) і для E.coli (резистентність до ампіциліну).
З літра дріжджовий культури виділяють безліч міліграм env-протеїну і потім тестують в досвіді по вакцинації. Результат вселяє надію: 10 кішок були імунізовані env-протеїном, причому 4 дали відповідь антитілами. Через 2 тижні провели зараження FeLV. Тепер всі тварини давали відповідь антитілами.

Таким чином, отримана вакцина виявилася ефективним засобом для боротьби з даним захворюванням.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Грен Е. Я., Пумп П. П. Рекомбінантні вірусні капсиди - нове покоління імуногенних білків і вакцин // Журнал ВХО. - 1988. - т.

II, №5. - С. 531-536.

2. Дмитрієв Б. А. Проблеми та перспективи створення синтетичних вакцин

// Імунологія. - 1986. - №1. - С. 24-29.

3. Лебедєв Л. Р., Сизов А. А., Масичева В. І., Карпенко Л. І.,

Рязанкін І. А. Молекулярний вектор для доставки генів у клітини-мішені // Біотехнологія. - 2001. - №1. - С. 3-12.

4. Мерців Н. П., Беклемишев А. Б., Савич І. М. Сучасні підходи до конструювання молекулярних вакцин. - Новосибірськ: Наука, 1987,

210 с.

5. Сизов А. А., Лебедєв Л. Р., Масичева В. І., Кашперова Т. А., Одегов

А. М. Розробка вірус-подібної конструкції для рецептор-опосередкованого транспорту гена Чг-КСФ в клітини кісткового мозку in vivo

Сторінки: 1 2 3 4 5