Реферати » Реферати з біології » Клонування

Клонування

кількох дорослих особин в таких умовах могло бути пов'язано з тим, що серед клітин епітелію кишечника розвивається пуголовка досить тривалий присутні первинні статеві клітини, ядра, яких могли бути використані для пересадки. У наступних роботах, як самого автора, так і інших дослідників не змогли підтвердити дані цих перших дослідів.

Пізніше Гердон модифікував експеримент. Оскільки більшість реконструйованих яйцеклітин з ядром клітини кишкового епітелію гинуть до завершення стадії гастулу, він спробував витягнути з них ядра на стадії бластули і знову пересадити їх у нові енуклеірованние яйцеклітини, така процедура називається «серійної пересадкою» . Число зародків з нормальним розвитком після цього збільшилася, і вони розвивалися до більш пізніх стадій в порівнянні з зародками, отриманими в результаті первинної пересадки ядер.
Потім Гердон разом з Ласки (1970 г од) стали культивувати in vitro (поза організмом в живильному середовищі) клітини нирки, легені і шкіри дорослих тварин і використовувати вже ці клітини як донорів ядер. Приблизно 25% первинно реконструйованих яйцеклітин розвивалися до стадії бластули. При серійних пересадках вони розвивалися до стадії пуголовка. Таким чином, було показано, що клітини 3-х різних тканин дорослого хребетного містить ядра, які можуть забезпечити розвиток по крайней може до стадії пуголовка.
У свою чергу ДіБерардіно і Хофнер використовували для трансплантації ядра неделящихся і повністю диференційованих клітин крові - еритроцитів жаби Rana Pipiens. Після серійної пересадки таких ядер 10% реконструйованих яйцеклітин досягали стадії плаваючого пуголовка. Однак навіть за допомогою багаторазових серійних пересадок
(більше 100 клітинних циклів) реконструйовані яйцеклітини далі стадії пуголовка не розвивалися.
Таким чином, у багатьох роботах показано, що у випадки амфібій донорами ядер можуть стати лише зародки на ранніх стадіях розвитку .. Деякі автори називають подібні експерименти клонуванням амфібій, хоча правильніше їх називати клонуванням ембріонів амфібій, так як в цьому випадку розмножують безстатевим шляхом не дорослі тварин, а їх зародків.
Диференціація клітин в ході розвитку хребетних супроводжується інактивацією непрацюючих генів, тому клітини втрачають тотіпотентность, диференціювання стає незворотною. Зрештою, у одних клітин відбувається репресування геному, в інших у тій чи іншій мірі деградує ДНК, а в деяких випадках руйнується навіть ядро. Проте на ряду з диференційовними клітинами, культивованими in vitro клітинні популяції містять малодіфференціруемие стовбурові клітини, які й можуть бути використані як донори ядер для клонування ссавців.
Досліди з амфібіями показали, що ядра різних клітин одного і того ж організму генетично ідентичні і в процесі діфференцірвкі поступово втрачають здатність забезпечувати розвиток реконструйованих яйцеклітин, однак серійні пересадки ядер і культивування клітин in vitro в якійсь мірою збільшують цю здатність.

Невдачі експериментів з мишами.

Успішні досліди з амфібіями змусили задуматися вчених про клонування ссавців, зокрема мишей.
МакКіннелла в одній зі своїх роботах зазначав, що необхідні для цього методи вже існують і незрозуміло чому миша до цих пір не клонована.
Однак пророкування МакКиннелла не справдилися, хоча наприкінці 70-х рр.. досліди на мишах дійсно почалися і протікали дуже драматично. До того часу досить грунтовно були вивчені біологія і генетика ранніх етапів розвитку ссавців і зокрема миші як модельного об'єкта.
Робота методично виявилася досить важким, насамперед, тому що обсяг яйцеклітини у ссавців приблизно в тисячу разів менше, ніж у амфібій. Однак ці труднощі були успішно подолані.
Експериментатори навчилися успішно мікрохірургічним шляхом видаляти пронуклеуси (одне з двох гаплоїдних ядер в яйці ссавців, в період після проникнення сперматозоїда, але до злиття жіночого і чоловічого пронуклеусов в ядро ??зиготи в процесі запліднення.
Чоловіче ядро ??формується з ядерного матеріалу сперматозоїда, жіноче з хромосом яйцеклітини) з зигот миші і пересаджувати в них клітинні ядра ранніх ембріонів. Проте всі отримані різним способом зародки мишей розвивалися лише до стадії бластули.
У 1977 році з'явилося сенсаційне повідомлення Хоппе і Илменсе про те, що вони отримали 7 дорослих самок мишей, п'ять з яких мали тільки материнський, а дві батьків геном. Це, нібито, залежало від того, який пронуклеус був залишений в яйці - жіночий або чоловічий, він і визначав особини по типу гиногенеза або андрогенеза
(гіногенез - розвиток яйця без участі сперматозоїда, андрогенез - розвиток яйця , що мають тільки батьківські хромосоми - чоловічий партеногенез). Їх успіх був пов'язаний, за описом авторів, з тим, що, видаляючи один пронуклеус, вони подвоювали число хромосом іншого, обробляючи яйця спеціальною речовиною, потім вирощували отримані диплоїдні гомозиготні зародки in vitro до стадії бластули і пересаджували в матку самки-реципієнта для подальшого розвитку .
Здавалося, тепер можна буде швидко отримати ссавців зі 100% гомозиготностью за всіма ознаками. Це особливо важливо для селекції, так як для отримання сільськогосподарських тварин, зокрема великої рогатої худоби з закріпленими особливо цінними якостями звичайними прийомами потрібні десятки років роботи.
Проте дані Хоппе і Ілменсі підтвердити не вдалося, хоча багато хто намагався це зробити. Виявилося, що отримані будь-яким способом диплоїдні андрогенетичним та гіногенетіческіе зародки мишей гинуть, а тих же стадіях, що і диплоїдні партеногенетические
(що розвиваються з незаплідненої яйцеклітини) ембріони.
Значно удосконаливши методи добування ядер і введення їх в клітку, МакГрат і Солтер провели свою серію експериментів і повідомили, що високий вихід живих мишей вони отримали, коли як донорів ядер вони використовували зиготи, але якщо донорами були ранні ембріони, то реконструйовані яйцеклітини, як і раніше, розвивалися лише до стадії бластули.
Метод МакГрата - Солтер став широко використовуватися різними експериментаторами. Так Манн і ловель-банжі виділяли пронуклеус яєць, активованих до партеногенезу, і пересаджував їх венуклеірованние зиготи мишей. У цих випадках ембріони гинули на ранніх стадіях.
Якщо ж, навпаки, пронуклеус отримували з запліднених яєць і пересаджували в партеногенетические та позбавлені ядра яйця, то такі зародки розвивалися нормально до народження.
Сурані з співавторами встановили, що якщо додати жіночі пронуклеус з зиготи миші до гаплоидному набору хромосом яйцеклітини, то нормального розвитку не відбувається, додавання ж чоловічого ядра призводить до нормального розвитку. З іншого боку, рекомбінація жіночого і чоловічого пронуклеусов з ранніх запліднених яйцеклітин мишей забезпечує нормальний розвиток, а комбінація 2-х чоловічих чи 2-х жіночих пронуклеус зупиняє розвиток ембріона.
Ці досліди показали, що для нормального розвитку ссавців потрібно два набору хромосом - батьківський і материнський. Тому ні у одного з відомого виду ссавців не описаний партеногенез.
Тому ж роботи Хоппе і Илменсе не вдалося повторити.
Однак такі дослідження ще двічі розбурхували наукове співтовариство.
У 1982 році пересадили ядра клітин партеногенетических бластул мишей венуклеірованние зиготи. Деякі з цих реконструйованих яйцеклітин нормально розвивалися, і нібито отримані чотири дорослих самки, але в світлі вищесказаного ці результати малоймовірні.
Загибель партеногенетических (гіногенетіческіх і андрогенетических) зародків у ссавців пов'язана з різною активацією онтогенезу материнського і батьківських геномів. Механізм, який регулює ці функціональні відмінності, був названий геномних імпрітінг і вивчався у ряді робіт, де було показано, що для нормального розвитку ссавців потрібна наявність чоловічого геному.
Інша стаття Илменсе і Хоппе мала ще більший резонанс. Автори повідомили про пересадки ядер внутрішньої клітинної маси бластули венуклеірованние зиготи мишей та отримання трьох дорослих особин (двох самок і одного самця), генетично ідентичною донорської лінії мишей. Введення ядер-донорів та видалення пронуклеус з зиготи проводили за прийом, потім реконструйовані яйцеклітини культивували in vitro до стадії бластули і пересаджували в матку самок. З 16 пересаджених бластул три розвинулися в дорослі особини.
У наступній роботі ці ж автори використовували як донорів-ядер клітини ембріонів ще більш пізній стадії (сім діб) і нібито отримали трьох статевозрілих мишей. Однак ніхто з працюючих у тому ж напрямку не зміг домогтися подібних результатів, і достовірність результатів Илменсе і Хоппе знову була поставлена ??під сумнів.
МакГрат і Солтер показали, що ядра 8-клітинних зародків і клітин внутрішньої клітинної маси бластули не забезпечують розвитку in vitro реконструйованих яйцеклітин навіть до стадії морули, що передує стадії бластули. Найбільша частина (5%) 4-клітинних зародків дає можливість розвиватися тільки до стадії морули. У теж час 19% реконструйованих яйцеклітин 2-ядерних клітинних зародків, змогли спокійно досягти стадії морули або бластули.
Ці та інші дані показують, що в ембріогенезі у мишей клітинне ядро ??рано втрачає тотіпотентность, що пов'язано, очевидно, з дуже ранньої активізацією геному зародка - вже на стадіях двох клітин. У інших ссавців, зокрема у кроликів, овець і великої рогатої худоби, активізація першої групи генів в ембріогенезі відбувається пізніше, на 8-16 клітинної стадії. Можливо, тому перші значні успіхи в клонування тварин були досягнуті на інших видах ссавців, а не на мишах.

Проте, особливий інтерес викликають досліди групи вчених з університету в Гонолулу на чолі з Ріузо Янагімачі. Авторам вдалося удосконалити метод Уилмута, про який мова піде нижче, вони відмовилися від електричної стимуляції злиття донорської соматичної клітини з яйцеклітиною і винайшли таку мікропіпетку, за допомогою якої можна було б безболісно витягати ядро ??з соматичної клітини і трансплантувати його в обез'ядренную клітку.

Сторінки: 1 2 3 4 5

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар