Реферати » Реферати з біології » Клонування

Клонування

Крім того, автори використовували в якості донорських відносно менш диференційовані ядра клітин, що оточують ооцит. Нарешті, вдалося, як би синхронізувати процеси, що протікають в яйцеклітині і трансплантіруемих в ньому ядрі, що дозволило забезпечити природні ядерно-цітолазматіческіе взаємини між ядром і цитоплазмою, оскільки трансплантіруемих диференційоване в певному напрямку ядро ??і цитоплазма яйцеклітини до того працювали як би в різних режимах.

Автори використовували для трансплантації ядра клітин, що оточують ооцит
(клітин так званого cumulus oophorus), клітин Сертолі з сім'яників і клітин, виділених з мозку. Ядра, виділені з соматичних клітин, ін'єктували в енуклєїрованноє яйце з допомогою микропипетки. Яйце активували до розвитку, помістивши в спеціальний розчин (так званий HEPES-CZB), вільний від кальцію, і додаючи стронцій і цітохалазін.Стронцій активував яйце, а кальцій придушував освіту полярних тілець. Ембріонів культивували до стадії 2-8 клітин, морули або бластули, а потім трансплантували в матку названої матері, де багато хто з них имплантировались і деякі з них (15-16%) продовжували свій розвиток. Відсоток виходу народжених мишенят (їх витягували за допомогою кесаревого розтину на 18, 5-19-й дні вагітності) був, однак, низький - у різних серіях експериментів від 2 до 2,8%. Молекулярні дослідження довели приналежність ядер народжених мишенят до клітин донора соматичних клеток.Такім чином, принаймні в деяких випадках доведена здатність ядер соматичних клітин забезпечувати нормальний розвиток ссавців.
Проте, роботи з мишами, незважаючи на їх непросту долю, значно розширили наші уявлення про методологію ссавців.

Кролики і корови.
Американські дослідники Стік і роблю, використовуючи метод Солтера і
МакГрата, отримали шість живих кроликів, пересадивши ядра 8-клітинних ембріонів однієї породи в позбавлені ядра яйцеклітини кроликів іншої породи . Фенотип народжених цілком відповідав фенотипу донора.
Однак тільки 6 з 164 реконструйованих яйцеклітин (3,7%) розвинулися в нормальних тварин. Це, звичайно, дуже низький вихід, практично не дозволяє розраховувати на отримання таким способом клону генетично ідентичних тварин. Цінність цієї роботи, тим не менш, в тому, що вона показала можливість клонування ембріонів кроликів.
Робота з реконструйованими яйцеклітинами великих домашніх тварин, корів чи овець, йде трохи по-іншому. Їх спочатку культивують НЕ in vitro, а in vivo - у перев'язаному яйцепровід вівці - проміжного (першого) реципієнта. Потім їх звідти вимивають і трансплантують в матку остаточного (другого) реципієнта - корови чи вівці відповідно, де їх розвиток відбувається до розвиненого дитинча. Уиландсин запропонував укласти реконструйовані яйцеклітини в агарових циліндр, який він потім трансплантували в перев'язаний яйцепровід вівці чи корови. За даними одних авторів реконструйовані зародки краще розвиваються в яйцепровід, ніж у культивованої середовищі, хоча деякі дослідники отримали непогані результати і при культивуванні in vitro.
Американці Роблю і його співробітники використовували щадний метод вилучення ядра без проколювання мембрани яйцеклітини, запропоновані
МакГрат і Солтер, пересаджували в зиготи так звані каріопласти - чоловічий і жіночий пронуклеуси разом з навколишнім їх цитоплазмою, а також ядра 2-, 4 - або 8-клітинних ембріонів корови.
Спочатку пронуклеуси центріфігуріровалі, щоб звільнити пронуклеуси від оточуючих їх гранул жовтка, після чого ядра було добре видно під мікроскопом, що значно полегшувало їх видалення. За допомогою маніпулятора і загостреною скляної піпетки витягували один з бластомерів разом з ядром з ранніх зародків і переносили його в енуклеірованную зиготи
Реконструйовані зародки були укладені в агарових циліндр і пересаджені в перев'язаний яйцепровід вівці. Через п'ять днів культивування їх вимивали, звільняли від агару і досліджували.
Реконструйовані зародки в цьому випадку розвивалися лише в тих випадках, де зиготи в зиготи пересаджували пронуклеус: 17% таких зародків досягли стадії морули або бластули. Два зародка були пересаджені другу реципієнту - в матку корови і розвиток їх завершилося народженням живих телят. Якщо в якості донорів використовували ядра 2-, 4 - і 8-клітинних зародків, то реконструйовані яйцеклітини не розвивалися до стадії морули
Пізніше були і більш успішні роботи. Уиландсин, зокрема, повідомив, що йому вдалося отримати чотирьох генетично ідентичних бичків холстейской породи в результаті пересадки в реціпіентние яйцеклітини ядер бластул одного 32-клітинного зародка. Автор стверджував, що більшість ядер зберігають тотіпотентность на 32-клітинній стадії, а значна їх частина 64-клітинної стадії, забезпечуючи нормальний розвиток реконструйованих яйцеклітин до стадії морули в яйцепровід.
Після пересадки в матку корів - остаточних реципієнтів. Як вважає автор, вони можуть і далі нормально розвиватися.
Бондіолі і співавтори, використовуючи як донорів ядер 16-64-клітинні зародки корів, трансплантували 463 реконструйованих зародка в матку синхронізованих реципієнтів, і було отримано 92 живих теляти. Сім з них були генетично ідентичні, бувши клон, отриманий в результаті пересадки ядер клітин одного донорського ембріона.
Таким чином, клітинні ядра зародків великої рогатої худоби досить довго зберігають тотіпотентность і можуть забезпечити повний розвиток реконструйованих яйцеклітин. Інакше кажучи, методичні труднощі клонування зародків великої рогатої худоби практично вирішені. Але залишається основне завдання - знайти донорські ядра, що володіють тотипотентностью, для клонування дорослих тварин.

Клонування овець.


Уиландсин ще в 1986 році показав, що ембріони овець на 16 - клетоной стадії розвитку зберігають свою тотіпотентность.
Реконструйовані яйцеклітини, які містять ядра бластомерів 16-клетоних зародків, розвивалися нормально до стадії бластули в перев'язаному яйцепровід вівці (в агарових циліндрі), а після звільнення від агару, пересаджували в матку вівці - другий реципієнта - ще на 60 днів. В іншому випадку донорами служили ядра 8-клетоних зародків і були отримані три живих ягняти, фенотип яких відповідав породі вівці-донора.
У 1989 році Сміт і Уилмут трансплантували ядра клітин 16 - клетосного ембріона і ранньої бластули в позбавлені ядра незаплідненої яйцеклітини овець. У першому випадку було отримано два живих ягняти, фенотип яких відповідав породу овець - донорів ядер.Во другому випадку один повністю сформувався ягня загинув під час пологів. Його фенотип також відповідав породу-донору.
Автори вважали, що в ході диференціювання ембріональних клітин відбувається інактивація деяких важливих для розвитку генів і в результаті ядра бластули не можуть репрограммироваться в цитоплазмі яйцеклітини і забезпечити нормальний розвиток реконструйованого зародка. Тому, на думку авторів, як донорів ядер краще використовувати 16-клітинні ембріони або культивовані in vitro лінії ембріональних клітин, ядра яких мають тотипотентностью.
Пізніше, в 1993-95 рр.., Група дослідників під керівництвом
Уилмута отримала клон овець - п'ять ідентичних тварин, донорами ядер яких була культура ембріональних клітин. Клітинну культуру отримували наступним чином: виділяли мікрохірургічним шляхом ембріональний диск з 9-денного овечого ембріона (бластули) і культивували клітини in vitro протягом багатьох пасажів (принаймні, до 25). Спочатку клітинна культура нагадувала культуру стовбурових диференційованих ембріональних клітин, але незабаром, після 2 -
3 пасажів, клітини ставали ущільненими і морфологічно подібними з епітеліальними. Ця лінія клітин з 9-денного зародка вівці була позначена як TNT4.
Щоб донорське ядро ??і реципиентная цитоплазма перебувала на східних стадіях клітинного циклу, зупиняли поділ культивованих клітин TNT4 на певній стадії (GO) і ядра цих клітин пересаджували венуклеірованние яйцеклітини (відповідно на стадії метафази II). Реконструйовані ембріони укладали в агар і трансплантували в перев'язані яйцепровід овець. Через шість днів ембріони вимивали з яйцепроводів проміжних реципієнтів і досліджували під мікроскопом. Відбирали ті, які досягали стадії морули і бластули і пересаджували їх в матку вівці - остаточного реципієнта, де розвиток тривав до народження. Народилося п'ять ягнят (самок), з них дві загинули невдовзі після народження, третя у віці десяти днів, а дві залишилися нормально розвивалися і досягли 8-9-місячного віку. Фенотипічно всі ягнята були схожі з породою овець, від якої отримували вихідну лінію клітин TNT4.
Це підтвердив і генетичний аналіз.
Ця робота, особливо в частині культури ембріональних клітин, - значне досягнення в клонування ссавців, хоча вона і не викликала особливого інтересу, як стаття того ж Уилмута з співавторами, опублікована в 1997 році, де повідомлялося, що в результаті використання донорського ядра клітини молочної залози вівці було отримано клонального тварина - вівця на прізвисько Доллі. Остання робота методично багато в чому повторювала попередні дослідження 1996 року, але в ній вчені використовували не тільки ембріональні, але ще й фібробластоподібних клітини (фібропласти - клітини сполучної тканини) плода і клітини молочної залози дорослої вівці. Клітини молочної залози отримували від 6-річної вівці породи Фінн Дорсет, знаходиться на останньому триместрі вагітності. Всі три типи клітинних культур мали однакове число хромосом - 54, як зазвичай у овець.
Ембріональні клітини використовували як донорів ядер на 7-9 пасажах культивування, фібробластоподібних клітини плоду на 4-6 пасажах і клітини молочної залози на 3-6 пасажах. Розподіл клітин всіх трьох типів оставлівалі на стадії GO і ядра клітин пересаджували венуклеірованние ооцити (яйцеклітини) на стадії метафази II. Більшість реконструйованих ембріонів спочатку культивували в перев'язаному яйцепровід вівці, але деякі ембріони культивували in vitro в хімічно певному середовищі. Коефіцієнт виходу морул і бластул при культивуванні in vitro в одній серії дослідів був навіть удвічі вище, ніж при культивуванні в яйцепровід
(тому мабуть немає суворої необхідності в проміжному реципієнті і можна обійтися культивуванням in vitro).
Вихід морул і бластул в серії

Сторінки: 1 2 3 4 5

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар