Реферати » Реферати по біології » Реєстрація сигнальних молекул

Реєстрація сигнальних молекул

зміст

| | СТР. |
| СПИСОК СКОРОЧЕНЬ | |
| ВСТУП | |
| 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ | |
| 1.1. ВИКОРИСТАННЯ TI-ПЛАЗМІД агробактерії В генетичної інженерії | |
| 1.1.1. Коротку характеристику AGROBACTERIUM TUMEFACIENS | |
| 1.1.2. Створення ВЕКТОРІВ НА ОСНОВІ TI-ПЛАЗМІД | |
| 1.1.3. ПРОЦЕСИНГ ТДНК В БАКТЕРІАЛЬНОЇ КЛЕТКЕ | |
| і її перенесення в клітини рослин | |
| 1.1.4. Розробка система трансформацій рослин з | |
| допомогою Agrobacterium tumefaciens | |
| 1.1.5. Проблема збереження чужорідних генів, | |
| перенесених в рослину | |
| 1.1.6. Аналіз експресії чужорідних генів у трансформованих | |
| рослинах | |
| 1.2. Використання методу генетичної | |
| інженерії для трансформації однодольних рослин | |
| 1.2.1. Короткі характеристики ряски | |
| 1.3. Сигнальні молекули, їх здатність індукувати процесинг | |
| тДНК | |
| 2. Матеріали і методи | |
| 2.1. Матеріали | |
| 2.1.1. Устаткування | |
| 2.1.2. Бактеріальні штами і плазміди | |
| 2.1.3. Рослини | |
| 2.1.4. Середовища мікробіологічні для | |
| культивування рослин | |
| 2.1.5. Інші розчини | |
| 2.1.6. Ферменти, використовувані в генній інженерії | |
| 2.1.7. Антибіотики | |
| 2.2. Методи | |
| 2.2.1. Інкубація Agrobacterium tumefaciens з | |
| ексудату тканин рослин | |
| 2.2.2. Виділення тотальної ДНК Agrobacterium tumefaciens | |
| 2.2.3. Блод-гібридизація тДНК по Саузерну | |
| 2.2.4. Трансформація клітин Esherichia coli | |
| 3. результати | |
| 4. обговорення | |
| 5. висновки | |

літератури | | | додаток | | |
СПИСОК скорочень

НУК - нафтіуксусная кислота
БАП - бензіламінопурін
MS -
LB - тДНК -
Ар - ампицилин
Cs - цефотоксін
ВСТУП
Актуальність роботи:
Властивість бактерій виду Agrobacterium tumefaciens викликати у рослин корончатий-галлову хвороба пов'язано з присутністю в їх клітинах великих (95
156 МДА) кон'югованих Ti-плазмід (від англ. tumor-inducing - викликає пухлину). В процесі идентифицирования рослин частина генетичного матеріалу Ti-плазмід - тДНК (від англ. Transferred DNA - передана) переміщається в рослинні клітини і інтегрується в хромосоми, залишаючись частиною спадкового матеріалу. Гени тДНК експресуються в трансформарованних рослинних клітинах, порушують їх фітогормональний баланс і визначають синтез специфічних-------з'єднань.
Таким чином, агробактерії є природними "генними інженерами", який здійснює вражаючий за філогенетичної дальності перенесення генетичної інформації. На основі агробактерій сконструйовані ефективні векторні системи для генетичної інженерії рослин.
Агробактіріальная трансформація відбувається в результаті складного процесу взаємодії між бактеріальними і рослинними клітинами. У цьому процесі однією з вирішальних стадій є рецепція агробактерій особливих сигнальних молекул, присутніх в ексудатах пошкоджених тканин рослин. Сигнальні молекули індукують експресію генів області vir
(агробактеріальної Ti-плазмід), контролюючих вирізання тДНК та її перенесення в клітини рослин. Агробактерільная трансформація спостерігається у широкого кола голонасінних і дводольних рослин, проте, вона відзначена лише у вельми незначного числа однодольних рослин. Однією з причин обмежень агробактеріальної трансформації однодольних вважається присутність в їх клітинах сигнальних молекул, індукують процесинг і перенесення тДНК.
Мета роботи:
В даний час є суперечливі дані щодо наявності таких сигнальних молекул у однодольних рослин. У зв'язку з цим, метою даної роботи був аналіз ряски на присутність у них сигнальних молекул, індукують процесинг тДНК.
1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1.1. Використання Ti-плазмід агробактерій в генетичної інженерії рослин
1.1.1. Коротка характеристика Agrobacterium tumefaciens

За останнє десятиліття в галузі генетичної інженерії рослин досягнуті значні успіхи. Були розроблені різноманітні методи генетичної трансформації і, в даний час здійснена експресія чужорідних генів в рослинах багатьох видів. Найбільш важливим для розвитку генетичної інженерії рослин було відкриття молекулярних основ пухлинних утворень за допомогою Agrobacterium tumefaciens [7].
Вірулентні штами Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae) характеризуються присутністю в клітинах великої плазміди, так званої Ti-плазміди, вагою більше 150 т.п.н. (Див. Додаток) [9].
Агробактерії викликають пухлинний ріст у багатьох дводольних і голонасінних, а так само у деяких однодольних рослин [2,3]. Для інфікування in vivo необхідно пошкодження тканин рослини [12].
Після прикріплення до клітинної стінки рослинної клітини агробактерії переносять частину Ti-плазміди (так званої тДНК) в ядро, де відбувається її стабільна інтеграція в хромосому рослини.
Доведено, що функція розпізнавання клітин і прикріплення до них, а так само вирізування, перенос і, можливо, інтеграція тДНК в рослинний геном кодується двома хромосомними генами - Chva і Chvb [13] і рядом генів vir - області, що знаходяться на Ti-плазміді [14].
Після перенесення в ядро ??рослинної клітини, тДНК може інтегрувати в геном у вигляді однієї або декількох копій [15]. Вбудована тДНК має властивості, характерні для ДНК еукаріот, що показано в експериментах по гіперчутливості до ДНК-азе I (Schafer, 1984). Залежно від типу Ti-плазміди, в тДНК перебуває від семи до тринадцяти генів, відповідальних за пухлинний фенотип. Гени 1 і 2 кодують ферменти, що у синтезі ауксина, индолилуксусной кислоти, в той час, як ген 4 кодує ізопентенілтрансферазу, що синтезує цитокинин ізопентеніла денозін 5'-монофосфат [16].
Одночасна транскрипція генів 1,2 і 4 призводить до підвищення рівня фітогормонів всередині трансформованих клітин. Результатом цього є підвищення мітотичної активності та утворення пухлини. Інші гени тДНК кодують синтез так званих опинилась, з яких найбільш вивчені нопапін і октопін. Опінію являє собою похідне амінокислот і цукрів, які служать джерелом живлення для агробактерій [14]. В цілому, освіта корончатого галла являє собою добре охарактеризований приклад генетичної інженерії рослин в природі.
Мутації в вірулентних генах агробактерій. Наявність Ti-плазмід в клітинах агробактерій є абсолютно необхідною умовою патогенності мікроорганізму. Вилікувані від Ti-плазмід штами агробактерій авірулентние.
На вірулентність Agrobacterium tumefaciens впливають різні мутації, картіруемие як на пухлинних плазмидах, так і на хромосомах.
Ранні етапи взаємодії агробактерій з рослинами, так само як хемотаксис, прикріплення до поверхні рослинної клітини і специфічне зв'язування в центрах інфекції контролюються генами, що мають хромосомну локалізацію. В хромосомі розташовані деякі гени, що регулюють експресію vir-генів Ti-плазмід [19]. Приєднання агробактерій до клітин рослини є одним з перших етапів, що визначають ефективну взаємодію. Цей етап у Agrobacterium tumefaciens контролюють два пов'язаних між собою хромосомних локусу Chva і Chvb, розмірами 1,5 kb і
5kb, відповідно [Дуглас та ін, 1985]. Гени цих локусів експрессируются конститутивно. В результаті транспозони мутагенезу цих областей отримують авірулентние або дефекнтие по прикріпленню агробактерії. Мутації в цих локусах сильно знижують або інгібують вірулентність бактерії, але не для всіх господарів. Локус Chvb визначає синтез нейтрального циклічного (-D-ГЛІКАНА, який трансформується в Периплазма клітини за допомогою продукту гена Chva. Роль нейтрального (-D-ГЛІКАНА в інфекційному процесі ще точно не встановлена. Крім циклічного (-D-ГЛІКАНА в прикріпленні патогенних агробактерій до рослинних клітинам беруть участь і інші полісахариди, зокрема позаклітинні екзополісахариди.
Організація vir-генів Ti-плазмід. Вірулентні гени агробактерій на Ti- і
Ri-плазмидах кластерізовани в області vir розмітив близько 30-35 kb, проявляємо у цих плазмидах значну гомологію ДНК. Виявлено також гомология vir-генів Ti-плазмід Agrobacterium tumefaciens з tra-генами кон'югітівних плазмід. В-----Ti-плазмидах в області vir локалізовано шість різних груп комплементаціі A, B, C, D, E і G, організованих в єдиний регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопіновая Ti-плазміда Arh 5 має додатковий локус vir F, розташований праворуч від локусу vir E [Kooykaas et al. , 1984]. Мутації в генах і---------vir A, vir G, vir B і vir D надають агробактерій авірулентний фенотип, на відміну від більшості хромосомних мутацій, що мають коло трансформованих рослин-господарів.
Продукти генів vir-області контролюють процесинг тДНК в бактеріальної клітці, її перенесення в рослинну клітину та інтеграцію в ядерний геном рослини, причому ці процеси гени vir можуть визначати не тільки в цис, але і в транс положенні по відношенню до тДНК (тобто перебуваючи в різних РЕПЛІКОН). Виходячи з цієї властивості області vir, сконструйовані і успішно використовуються в практиці зручні бінарні вектори для генетичної інженерії рослин [Дрейпер з співавт, 1991]. Для процесів "вирізування" тДНК з плазміди (точніше, вивільнення в процесі репликативного синтезу) та її переносу в рослину необхідно фланкування цій області особливими кордонами: недосконалими прямими повторюваними послідовностями ДНК розміром 24----, але виявляють значну гомологію у всіх вивчених Ti- і Ri-плазмід. Кордони тДНК гомологични області oriT кон'югатівних плазмід.
У цій області сайт-специфічні ендонуклеази виробляють одноланцюговий розрив, службовець початком реплікації за типом розмотується рулону, яка відбувається у процесі транспорту плазміди. Реплікація забезпечує збереження плазміди в материнській клітині і поява її копії в дочірній.
Для нормального процесингу тДНК та її перенесення в рослинну клітину особливо важлива її права кордон, яка одна може визначати полярність переносу тДНК. Видалення правої межі з Ti-плазмід робить агробактерії повністю авірулентними. Заміна її на штучно синтезовану, так само як і на ліву, відновлює вірулентність мікроорганізму.
На процесинг тДНК в клітинах бактерій впливають мутації в генах vir D, vir C і vir E - оперонов, на транспорт т-комплексу в рослинну клітину - мутації в генах vir B і vir D - оперонов.

1.1.2. Створення векторів на основі Ti-плазмід

На початку вісімдесятих років були зроблені перші спроби перенести чужорідні послідовності ДНК в рослинні клітини або за допомогою транспозони мутагенезу [Uernals-teens et al., 1980], або шляхом сайт - специфічної міграції генів в тДНК і подальшої подвійний рекомбинацией с
Ti-плазмидой дикого типу [Matrke

Сторінки: 1 2 3 4

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар