Головна
Реферати » Реферати по біології » Реєстрація сигнальних молекул

Реєстрація сигнальних молекул

et al., 1981; leemans et al., 1981].
Однак, ці ранні експерименти, засновані на подвійний рекомбінації, займали багато часу, були досить складні і трансформації проходили з дуже низькою частотою. Необхідно було розробити більш ефективні вектори, щоб полегшити генетичні маніпуляції з бактеріями і дозволити селекцію і регенерацію трансформатов.
Зараз використовують дві принципово різні системи для введення чужорідних генів в рослини за допомогою Ti-плазмід:
---вектори бінарні вектори.
В основі створення---векторів лежить той факт, що гени тДНК НЕ---для рослинних клітин, і будь-яка последовтельность ДНК, вбудована між кордонами тДНК, може інтегрувати в хромосому рослинної клітини і нормально там експресуватися [Zambryski et al., 1983]. В---Вектор системах тДНК можна замінити, наприклад, на послідовність pBR322, а чужорідну ДНК, яку передбачається перенести в рослини, потрібно проклоніровать в цьому ж векторі.
Потім шляхом гомологічною рекомбінації ця чужорідна ДНК може бути перенесена на Ti-плазміду реципієнтного штаму агробактерії (рис. 2). Одним з перших таких векторів на підставі Ti-плазмід авляются pGV3850
[Zambryski et al., 1983]. У ньому все гени, відповідальні за синтез фітогормонів, були замінені на послідовність pBR322.
ДНК pBR322 забезпечувала гомологию для---області тДНК pGV3850 з будь-якими виробляли pBR, несучими клонований ген.
Гени, що кодують різні маркерні білки для швидкого відбору трансгенних рослин, були вбудовані в pGV3850 [De Blocle, 1984]. Була розроблена система трехродітельного схрещування для перенесення будь-яких похідних pBR322 з E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983]. В даний час сконструйовані і успішно використовуються й інші---вектори на основі Ti-плазмід [Royers et al., 1988].
Рис. 2.
Схеми---(А) і бінарної (Б) векторних систем. vir - область вірулентності. HOM - області гомології, в межах яких може відбуватися рекомбінація, яка веде до утворення коінтегратов. LB і RB - ліва і права кордону тДНК. MCS ---сайт для клонування. РТМ - маркет трансформації для рослин. RES - маркер стійкості до антибіотика для бактерій. OriT - початок переносу і bom-сайт для мобілізації векторів при кон'югації. Col E1 - початок реплікації з плазміди Col E1. RK2 - початок реплікації з плазміди широкого кола господарів RK2.
Система бінарних векторів заснована на тому, що область тДНК і гени vir можуть розташований на різних плазмидах [Hockemu et al., 1983]. В таких системах зазвичай присутні два елементи:
Ti-плазміда-помічник, в якій тДНК польностью делетірована. Ця плазміда несе в своєму складі гени vir, діючі in trans.
Плазміда широкого кола господарів, що має сайти для клонування та маркерні гени для селекції рослин, обмежені правої і лівої фланкуючими послідовностями тДНК [An et al., 1988] рис
Обидві описані вище системи векторів припускають---етапах складання потрібних конструкцій у проміжних векторах, наприклад в pAP2034 [Veltena,
Sehell., 1987] або pRT103 [Topter et al. , 1983] а потім перенесення з в готовому вигляді в рецепіентние штами агробактерій.

1.1.3. Процесинг тДНК в бактеріальної клітці і її перенесення в клітини рослин
Форми процессірованной тДНК. При культивуванні Agrobacterium tumefaciens з механічно пошкодженими частинами рослин, що регенерують протопластами або в присутності---з клітин бактерій можна виділити різні молекулярні форми процессірованной тДНК - одноцепочечниє лінійні, двуцепочечние лінійні і двуцепочечние кільцеві, які можуть претендувати на роль посередника в перенесенні генетичного матеріалу в рослинну клітину [---, 1980]. Причому кільцева форма, що утворюється за рахунок гомологичной рекомбінації між правою і лівою кордоном тДНК з утворенням однієї гібридної кордону, зустрічається в дуже малих кількостях. При її утворенні не відбувається репликативного синтезу ДНК, в той час як в разі утворення двох інших форм, можливе проходження реплікації тДНК в бактеріях в процесі її транспотра в рослини (до появи одноланцюгових форм може приводити переривання, інгібування переривчастого синтезу запізнілої ланцюга). Реплікація покликана забезпечити збереження тДНК у вихідній Ti-плазміді, якщо тільки не допустити можливість існування фізичного вирізання матеріалу тДНК з Ti-плазмід за рахунок утворення дволанцюжкових розривів в кордонах.
Зникнення тДНК з Ti-плазмід є головним недоліком що відійшла на другий план подібної "ексцезіонной моделі". Тим не менш, освіта дволанцюгових розривів всередині кордонів і поява детектіруемих кількостей лінійної двуцепочечной форми тДНК при культивуванні бактеріальних клітин у присутності---дослідники спостерігали вже через 30 хвилин після додавання цього індуктора в середу. Так само в умовах індукції vir-генів---
---в клітинах агробактерій виявляється лінійна одноцепочечная форма процессірованной тДНК [Stachel et al., 1986].
Поява цього интермедиата виявляється через вісім годин після додавання індуктора, і його кількість накопичується впродовж подальших 40 годин більш, ніж в два рази, а потім йде на спад, показуючи, що процес лімітований.
Яка з форм транслоціруется через бактеріальну мембрану в бактеріальну клітину досі залишається не з'ясованим через труднощі визначення відносної кількості кожної з форм і виявлення динаміки їх перетворення. Можливо, процесинг і транспорт тДНК НЕ роз'єднані в часі і йдуть сопряженно подібно Кон'югаційна переносу плазмід, що відбувається в місці контакту мембран кон'югується клітин [Clark and Warren, 1979]. Тоді все виявляються інтермедіати можуть бути аберантних формами перерваного на якомусь етапі неподільного процесу (або неправильно завершеного). У разі індукованої експресії vir-генів---відсутній головний елемент взаємодії - контакт бактеріальної клітини і рослинної клітини, і, тому, все виявляються в цьому випадку форми можуть претендувати на роль посередника лише з певними припущеннями.
Достовірно відомо, що в рослинну клітину потрапляє лише одна ланцюг тДНК і конвертується в двуцепочечную вже в рослинній клітині.
Обговорюється, що в разі проходження в клітці Agrobacterium tumefaciens---
---напівконсервативної реплікації тДНК другий ланцюг може в процесі перенесення гидролизоваться, вивільняючи енергію для транспорту яку переносять ланцюга.

1.1.4. Розробка система трансформацій рослин за допомогою Agrobacterium tumefaciens

Більшість початкових експеріметнов по генетичній трансформації рослин було зроблено за допомогою зараження поранених рослинних клітин за допомогою агробактерій з немодифікованими Ti-плазмідами. Для збереження стерильності часто інфікували експлантати in vitro замість цілих рослин. Бактерії потім видаляли, додавали в середу цефотоксін або карбенициллин. Трансформантів відбирали на безгормонального середовищі.
Надалі в міру створення обеззброєних векторів і нових селективних маркерів, був розроблений більш ефективний метод, що дає велике число трансформантов: кокультівірованіе агробактерій з рослинними протопластами або з експлантантамі листя. Було показано, що кокультівірованіе протопластов з агробактерій, або з бактеріальними---
---, призводить до утворення пухлини [Marton et al., 1979, Wullems et al.,
1981]. Потім подібний підхід був успішно застосований для трансформації рослинних клітин агробактерій, що несуть у складі тДНК химерні селективні маркери [Fraley et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983].
Цей метод був надалі поліпшений використанням так званих фідерних культур [Fraley et al., 1983]. Однак, всі перераховані методи придатні тільки для трансформації рослин, які можна легко регенерувати з протопластів (наприклад, тютюн і петунія). Цю проблему мрожно легко подолати кокультівіруя агробактерії з листовими дисками замість протопластов [Horch et al., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd et al., 1986].
Стерильні листові диски---з агробактерій, що несуть у складі обеззброєного вектора будь-якої селективний маркер стійкості до антибіотика. Потім шматочки листя культивують два дні на фідерних чашках з середовищем для утворення пагонів. Після цього їх переносять на середовище з цефотоксіном для знищення бактерій і з яким-небудь антибіотиком
(наприклад, з---) для відбору трансформантов. Регенерувати пагони дають коріння, після чого рослини переносять в грунт для проведення подальших експериментів.
Оскільки метод трансформації листових дисків являє собою ідеальне поєднання високої частоти трансформації з легкою та швидкою--- і регенерацією трансформантов, цей підхід стали використовувати в багатьох лабораторіях світу. Крім того були запропоновані деякі модифікації методу.
Для підвищення частоти трансформації листових дисків Arabiodopsis було запропоновано обробляти агробактерії---[Sheikholeskam a. Week S,
1987], який є індуктором генів vir [Stachel et al., 1985]. Однак метод трансформації листових дисків застосуємо для трансформації тільки тих видів рослин, які можуть регенерувати пагони з недиференційованих клітин в місці пораненія.
Поряд з методом трансформації листових дисків широко використовуються кон'югірованние агробактерії з стебловими сегментами [An et al., 1986], клітинами суспензованих культури [Scott a. Draper, 1987], мікрокаллусамі
[Pollock et al, 1985] і прорастающими насінням [Feldmam a. Markis, 1987].
Метод трансформації насіння агробактерій був вперше застосований для арабидопсиса і заслуговує на особливу увагу, так як не вимагає роботи з культурою тканини.

1.1.5. Проблема збереження чужорідних генів, перенесених в рослину

Чужорідні ДНК, перенесені в рослинні клітини за допомогою різних методів, звичайно вбудовуються в ядерний геном і успадковуються відповідно до законів Менделя [De Block et al., 1984; Horsch et al., 1984]. Області інгераціі, по видимому, розподілені випадковим чином по геному.
Вбудовування генів по певних сайтів було раніше описано в системах тварин клітин [Smithies et al., 1985; Maniatis, 1985] і нещодавно подібний підхід був успішно застосований для трансформації рослин [Paszkowski et al.,
1988].
У більшості випадків послідовності чужорідної ДНК вбудовуються в один локус або в одній копії, або у вигляді кластера тандемних вставок, що було показано за допомогою гібридизації

Сторінки: 1 2 3 4