Реферати » Реферати по біології » Реєстрація сигнальних молекул

Реєстрація сигнальних молекул

in situ [Mouras et al., 1986]. Однак, часто спостерігаються множинні вставки в два або більше ділянок на різних хромосомах [De Block et al., 1984; Peerbolte et al., 1986a, b; Feldmann a.
Marus, 1987]. У зв'язку з цим у багатьох случах була отримана контрансформація фізично незчеплених генів, сегрегація деяких проходила в поколінні F1 [De Framond et al., 1986; Simpson et al., 1986].
Чужеродине гени зазвичай передаються потомству з високим ступенем стабільності при мейозі [Muller et al., 1987]. Однак, іноді спостерігали випадкову втрату трансформованого фенотипу після мейозу [Potrykus et al., 1989].
Возмножность, це відбувалося через активації чужорідного гена (наприклад, при метилировании ДНК). Інтеграція чужорідної ДНК під внеядерние геноми, наприклад, в хлоропластної ДНК [De Block et al., 1980], так само відбувається по неменделевскому типом успадкування - по материнській лінії.
Використовуючи метод гібридизації по Саузерну [Southern, 1975] для аналізу трансформантов та їх потомства, багато дослідників показали, що часто спостерігається вбудовування укорочених, тандемних або перебудованих копій чужорідних генів, особливо після прямого переносу ДНК в протопласти [Krens et al., 1985]. Поява тандемів, часто від 5 до 20 копій, можна пояснити рядом рекомбінацій перед інтеграцією в геном [Szernilofsky et al., 1986;
Wirtz et al., 1987]. Освіта інвертованих повторів є основним типом перебудов чужорідної ДНК при застосуванні векторів, що містять тДНК---
- Ti-плазміди [Jorgensen et al., 1987].
Отже, при проведенні дослідів з трансформації рослин, необхідно брати до уваги той факт, що чужорідна ДНК може піддаватися різним модифікаціям перед встраиванием в геном господаря. Однак, і після інтеграції можуть відбуватися різні її перебудови, зазвичай під час мейозу
[Czernilofsky et al., 1986]. В таких випадках тільки перехресне запилення ретельно відібраних трансформантов з найбільш бажаним генотипом і фенотипом дає потомство з передбачуваними прізанакамі.

1.1.6. Аналіз експресії чужорідних генів у трансформованих рослинах

Для якісного та кількісного аналізу експресії чужорідних генів у рослинах використовують безліч методів, включаючи Нозері-аналіз РНК [Nagy et al., 1988] і Вестер-аналіз продуктів трансдукції [ Burnette, 1981]. Крім того, вивчають фенотипічні ознаки такі як, стійкість до антибіотиків і гербіцидів. Для аналізу експресії таких репортерних генів, як cat, npt II, гени октопін- і--------розроблені чутливі методи
[Otten a. Schilperoort, 1987; Gorman et al., 1982].
Такого роду аналіз може мати велике значення, оскільки можна комбінувати кодують послідовності репортерних генів з підходящими регуляторними послідовностями рослинних генів, або створювати подвійні гени, експресуються з одного і того ж промотора. Активність гена і промотора можна таким чином визначити або за допомогою ферментативного аналізу, або гібридизацією рослинної РНК з зондами, комплементарними репортерного гену.
Перераховані вище різноманітні методики можна успішно застосовувати для аналізу експресії чужорідних генів в трансгенних рослинах, зокрема, генів стійкості до гербіцидів, комах, опроміненню, антибіотиків і ін.

1.2. Використання методу генетичної інженерії для трансформації однодольних рослин
1.2.1. Короткі характеристики ряски
Сімейство Ряскова, Lemnaceae включає 6 родів і 30 видів, що зустрічаються на всіх континентах. Найбільш широко вони поширені в Північній і Південній
Америці, Африці, Австралії. Представники сімейства Ряскова є найменшими в світі квітковими рослинами, віночки яких рідко перевищують 1 см. В результаті гидрофильной еволюції вони досягли крайнього ступеня редукції всіх своїх органів, тому і по простоті будови займають перше місце серед квіткових.
Ряскової - водні, свободноплавающие, здебільшого багаторічні трав'янисті рослини. За своєю природою Ряскова є неотенічеського формами відбулися від предків сучасної водоплавающего роду Пистия з сімейства ароїдних. Ряскова служать кормом для диких і домашніх качок, а так само інших водоплавних і болотних птахів, для риб, особливо коропа, і ондатри. У сільському господарстві їх використовують у свіжому і сушеному вигляді як цінний білковий корм для свиней та домашньої птиці. Застосовуються Ряскова і для очистки води, так як беруть із неї і запасають у своїх листах азот, фосфор, калій, а так же поглощіют вуглекислий газ і збагачують воду киснем. Вживаються і людиною.
За останні 50 років Ряскова розглядаються, як надзвичайно цінний експериментальний об'єкт для морфогенетических, фізіологічних і біохімічних досліджень завдяки невибагливості до середовища, малим розмірам, швидкому зростанню, що дозволяє використовувати всього один генетичний клон протягом усього експерименту .

1.3. Сигнальні молекули, їх здатність індукувати процесинг тДНК

Експресію генів vir-області індукують специфічні сигнальні молекули допомогою позитивної регуляції системи до складу якої входять гени virA і virG [Melchers et al., 1986; Stackel, Zambryski, 1986].
Активаторами транскрипції vir-генів є низькомолекулярні моноциклічні фенольні сполуки, синтезовані в механічно пошкоджених тканинах рослин [Stuchel, 1985]. Прикладами таких сполук є----------- і досить широке коло похідних-------биосинтетического шляху метаболітів захисної природи або попередників лігніну.
Сигнальні молекули були вперше виявлені в ексудатах коренів і листя двудольного рослини Nicotiano tabacum, вони були ідентифіковані як----- і-------. Ці сполуки синтезували метаболічно активні пошкоджені тканини рослин. В даний час встановлена ??сигнальна індукують активність у великої групи-------з'єднань рослинної природи.
Механічне пошкодження тканин рослин призводить до посилення синтезу таких сигнальних з'єднань. Відомо, що------------ і корична кислоти, що проявляють сигнальну активність, мають так само антимікробними властивостями і є проміжними метаболітами на шляху синтезу-------.
----------Розпізнаються специфічними рецепторами агробактерій, які є трансмембранними хеморецептргимі білками з різною-------до таких молекулам [Leroux, 1987]. Для оптимальної індукції експресії генів vir потрібна присутність в ексцудатов рослин різних вуглеводів: глюкози, глюкуроновою кислоти, галактози, галактуроновой кислоти, арабінози, манози, фукози, целлобіози і ксилози, що представляють компоненти клітинної стінки рослин. Такі вуглеводи зв'язуються з периплазматических доменом рецептора у вигляді попередньо обробленого комплексу з белком-продуктом хромосомного вирулентного гена Chv E, причому кінцевий результат індукції процесингу тДНК залежить від синергічної активності сигнальних з'єднань і цукрів ексцудатов рослин.
Структурна формула:

Позитивна регуляторна система vir A - vir G, контролююча експресію генів vir-----, працює таким чином. Експрессіруемий конститутивно ген vir A виконує функцію рецепції сигнальних молекул рослин і трансмісії цього сигналу в бактеріальну клітину. Цей мембранний хеморецепторами після прийняття зовнішнього сигналу активує продукт гена vir G, який в свою чергу виступає в качетве позитивного регулятора власної транскрипції і транскрипції інших генів vir-----.
Механізми активації наступні.
Білок vir A, двічі пронизливий мембрану бактерії, при появі сигнальних молекул автофосфоріліруется---------на своєму С-кінці, переходячи в активну форму. (У відсутності індукції С-термінальний домен білки vir A взаємодіють з W-термінальним доменом, ингибируя кіназного активність).
Активоване білок vir A в свою чергу---------внутрішній клітинний білок - трансдуктор сигналу vir a по залишку аспарагіну - 52 [Jin et al.,
1990]. Фосфорілірованний білок vir G зв'язується з промоторами інших генів регулона і зі своїм власним, виступаючи в якості транскрипційного активатора. Індукція vir генів оборотна, і каскад реакцій може бути перерваний, що дуже важливо для патогена: у випадку, якщо господар хворий і нежиттєздатний організм, перенесення тДНК в його клітини не здійснюється [Hess et al., 1991].
Крім позитивної регуляторної системи vir A - vir G, локалізованої на Ti-плазміді, в регуляції експресії vir-генів беруть участь також хромосомні гени. Про це свідчить виявлення спонтанного хромосомного мутанта ros, у якого гени vir C і vir D - оперонов експрессируются в відсутність сигнальних молекул рослин.
3. Матеріали і методи
2.1. Матеріали
2.1.1. Обладнання

копалку, термоміксера 5436, центрифуга "Еппіндорф", прилад для горизонтального електрофорезу, джерело живлення 2197, термостат ТС-80 Мг.

2.1.2. Бактеріальні штами і плазміди

Штам: | Escherichia coli
HB 101
Agrobacterium tumefaciens
C58C1 | | Плазміди: | рGV3850 | | тДНК: | рBR322 маркер Ар, Тс | |
2.1.3. Рослини

Як об'єктів дослідження використовували дво, тримісячне однодольное рослина ряски крихітної (Lemna perpusilla).
Рослини вирощували в теплиці в вегетаційних судинах при температурі
18-250 С і 12 годинному світловому періоді. Відносну вологість повітря в теплиці підтримували в межах 65-70%. Для аналізу брали стерильні тканини листя. Стерилізацію проводили гипохлоридом натрію протягом 5-10 хвилин, а потім матеріал 3 рази промивали стерильною водою і використовували в експериментах по індукції vir-генів Ti-плазмід. Для порівняння були взяті дводольні рослини тютюну червоного і льону довгунця.

2.1.4. Середовища мікробіологічні для культивування рослин

У роботі використовували середовища:
Для мікроорганізмів - LB (Лурія-Бертані)
NaCl
Дріжджовий екстракт
Бантотріптон | 10 мг / л
5 г / л
5 г / л | | рН 7,5
Температура 240 С
Довжина світлового дня 16 годин
На чашку Петрі:
LB штам | 10 мл
1 мл | | Для культивування рослин - середа MS (Мурасіге-нудьгуючи) приведена в таблиці.

2.1.5. Інші розчини

Фосфатне буфер
ТІ буфер (10 мМТріс-HCl (pH 8.0), 1 мМ ЕДТА)
Саркозілат Na
проназа - 1,5 мг / мл
Фенол
Хлороформ
агарозном гелі
Фітогормони:
БАП (6-бензіламінопурін) розчиняли в розчині 0,1 - NaOH
HУК (2-нафтілуксусная кислота) розчиняли в етанолі і розводили водою до 10 мг / мл. Стерилізували фільтруванням через фільтри В 485.
ацетосірінгону розчиняли в 70% спирті (етанолі) в концентрації 10 мг / мл.
Додавали в середу MS до кінцевої концентрації 100 мМ.

2.1.6. Ферменти, використовувані в генній інженерії Гідроліз ДНК проводитьрестрикційних ендонуклеазами:

Hind III, Bam Hi, Sal I, Eco RI.
2.1.7. Антибіотики

Ампіцилін 50, Н2О 50. Для селекції бактерій з певними плазмидами.

Методи

2.2.1. Інкубація Agrobacterium tumefaciens з ексудатом тканин рослин
Нічну культуру A. tumefaciens

Сторінки:

Страницы: 1 2 3 4

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар