Реферати » Реферати по біології » Реєстрація сигнальних молекул

Реєстрація сигнальних молекул

С58С1 (pGV3850), вирощену на ротаційному шейкері (20 циклів / хв) при 290 С в рідкому середовищі LB, збирали центрифугуванням і суспензованих в середовищі МС - 0,1 М фосфатному буфері (рН
5,5) до кислотності А600 - 0,05.
Після 5:00 росту в бактеріальну культуру додавали поросяти, ягняти стерильні тканини рослин (листя, стебла) у кількості 2 г на 10 мл середовища і продовжували інкубацію протягом 48 годин.
В качетве позитивного контролю використовували агробактеріальної культуру з додаванням як індуктора 100 мкМ ацетосірінгона. В якості негативного контролю використовували агробактеріальної клітини, вирощені на середовищі без ацетосірінгона і ексцудатов рослин.
Ефективність індукції процесингу тДНК Церез 48 годин інкубації агробактерій з тканинами рослин. Титр життєздатних бактерій після інкубації з ексцудатов рослин перевіряли шляхом їх висіву в різних розведеннях на чашки Петрі з агаризованому середовищем LB. Кожен варіант дослідів проводили в трьох повторностях.

2.2.2. Виділення тотальної ДНК Agrobacterium tumefaciens

ДНК виділяли за модифікованим методом Draper з соавт.Через 48 годин спільного культивування агробактерій з тканинами рослин з пробірок видаляли рослинну тканину, бактерії збирали, центруфугіровалі при 9000 g.
Осад, отриманий з 10 мл інкубаційного середовища ціалізуватися протягом 45 хв при 370 С в 500 мкл ТЕ буфера (10 мМ трісHCl (pH 8,0), 1 мМ ЕДТА), що містить 1% сарколізата Na і 1,5 мг / мл пронази. Лізат двічі екстрагували фенолом і двічі хлороформом. ДНК осаджували спиртом і розчиняли в ТЕ-буфері.

2.2.3. Блод-гібридизація тДНК по Саузерну

В цілях додаткової перевірки наявності індукції процесингу і присутності в пробах pBR322 татальную ДНК агробактерій в кількості 5 мкг наносили в лунки 0,8% агарозного гелю і проводили електрофорез при 25-100 В протягом
2:00 в буфері, що містить: 40 мМ трис-ацетат (рН 8,0), 1 мМ ЕДТА і 5 мкг / мл бромистого етидію. В якості маркерів молекулярної ваги використовували ДНК фага (, гидролизованную рестріктазного ендонуклеазою Hind
III. Блод-гібридизацію проводили на-----фільтрах. Як зонд использвать ДНК плазміди pBR322, мічену 32 - з допомогою ДНК-полімеразної системи.

2.2.4. Трансформація клітин Esherichia coli

Штами E. сoli HB101 вирощували в рідкому середовищі LB при 370 С до концентрації
5 * 107 клітин / мл (А600 = 0,45). Для кількісного вивчення процесингу тДНК використовували комплементарні клітини бесплазмідного штаму E. сoli
HB101, які трансформували тотальної ДНК агробактерій, яка була виділена (М-2), що зазнали різну переробку. Трансформантів кожного варіанту висівали на три чашки Петрі з агарізірованной середовищем LB, що містить ампицилин (50 мкг / мл). Кількість колоній підраховували. В контрольних експериментах клітини трансформували плазмидой pBR322, і інший контроль не піддавалась трансформації і колоній виявлено не було.

3. результати

Для виявлення процесингу агробактеріальної тДНК, індукованого ексудату аналізованих рослин, в роботі застосовували метод "порятунку плазміди", запропонований Koukolikova-Nikola з співавт. Цей метод заснований на використанні модифікованої Ti-плазміди pGV385 [11], яка містить між правою і лівою кордонами значно делетірованной вихідної тДНК бактеріальної плазміди вектор pBR322. Таким чином, індукування процесингу тДНК в модифікованої Ti-плазміді pGV3850 можна простежувати з вирізання з неї низкомолекулярного фрагмента ДНК, до складу якого входить плазмида pBR322. Цей процес можна тестувати різними методами.
Один з них - це трансформація клітин E. сoli тотальної агробактеріальної
ДНК і відбір трансформантов по селективним маркерним ознаками плазміди pBR322 - стійкою до антибіотиків. Іншим методом може бути блод-гібридизація - аналіз тДНК за допомогою плазміди pBR322 в якості гібридизаційного зонда. Обидва ці методи були використані в даній роботі. Порівняли ефективність індукції процесингу ексудату різних рослин проведено по відношенню до активності 100 мкМ ацетосірінгона.
Відомо, що це токсіфенольное з'єднання, що виділяється деякими дводольними рослинами, належить до сигнальних молекул, індукують вирізання і перенесення агробактеріальної тДНК.
Результати трансформації клітин E. сoli НВ101 тДНК підданих впливу ексудатів листя різних рослин представлені в таблиці.
Таблиця 3.1.
Фактори індукції | Кількість трансформованих E. Coli | | L. perpusilla
(ряска)
L. perpusilla (ряска)
ацетосірінгону (контроль)
Льон довгунець
Nicotiana tabacum (тютюн)
Без ацетосірінгона і трансформації | 25 колоній
30 колоній
35 колоній
40 колоній
30 колоній
- | |
ексудатах листя ряски индуцировали вирізання тДНК, що є доказом присутності в їх складі сигнальних з'єднань, специфічних для індукції транскрипції генів vir агробактеріальної Ti-плазміди.
Прямий блод-гібрідізаціонний аналіз тДНК агробактерій свідчить про присутність у ряски сигнальних молекул, індукують утворення тДНК [12].

4. обговорення

Використаний підхід дозволяє реєструвати присутність сигнальних молекул в ексудатах різних тканин рослин по одному з найважливіших результатів індукції генів області vir, а саме з вирізання тДНК з агробактеріальної Ti-плазміди. У цій роботі ми застосували два методи детекції процесингу тДНК модифікованої агробактеріальної Ti-плазміди.
PGV3850 [11].
Отримані результати дозволяють розширити список однодольних рослин (на одну рослину), синтезують сигнальні молекули, що індукують процесинг агробактеріальної тДНК. Застосований метод "порятунку плазміди" дозволяє виявляти поява циклічних форм модифікованої тДНК pBR322 та її лінійних форм [20].
Розглянутий в роботі метод дозволяє враховувати присутність в ексудатах рослин речовин з бактериостатической активністю. Речовини такої природи можуть істотно впливати на ефективність трансформації рослин агробактерій.
Ми не аналізували хімічну природу сигнальних молекул ряски. Не виключено, що сигнальні молекули можуть відрізнятися від сигнальних фенольних сполук дводольних рослин. Специфічний процес взаємодії між агробактерій і покритонасінних рослин існував, мабуть, ще до їх дивергенції на дводольні та однодольні [15].
Штами агробактерій володіють багатьма особливостями і саме рецептори
(продукти гена vir A), що розрізняються за здатністю дізнаватися сигнальні молекули різної природи.
Слід зазначити, що рослинні речовини з сигнальною функцією для агробактерій не є унікальним прикладом існування сполук, що виконують цю важливу роль у взаємодії мікроорганізмів з рослинами
[22].
Молекулярні сигнали рослин відіграють важливу роль у встановленні паразитичних і симбіотичних взаємовідносин між бактеріями і рослинами, визначаючи при цьому коло рослин для певного мікроорганізму. Всебічні структурно-функціональні дослідження специфічних молекулярних сигналів у взаємодії між мікроорганізмами і рослинами повинні відповісти на численні запитання про молекулярно-генетичних механізмах цих взаємин і сприяти розвитку ефективних методів генетичної інженерії найважливіших сільськогосподарських і екологічно-індикаторних культурах рослин (як ряска).

Писок літератури

1.
2.


3.

4.

5

6.

7.

8.

9.

10. | Аналіз генома. Методи. Под ред. Н. Дейвіса. - М .: Мир, 1990. - 247 с.
Великов В.А., Бур'янов Я.І. Освіта делеционного похідних Ti-плазміди pGV3850 при Кон'югаційна перенесенні з Agrobacterium tumefaciens в
Escherichia coli. // Генетіка.1998. №8. т. 34. с. 1056-1062.
Великов В.А., Бур'янов Я.І. Вивчення Кон'югаційна транспорту Ti-плазміди pGV3850 з Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. // Тези доповідей
III Пущинської конференції молодих вчених. Пущино, 27-30 квітня 1998 р, с.
49.
Генна інженерія рослин. Лабораторне керівництво. - М .: Мир, 1991. - 408 с.
Клонування ДНК. Методи. Под ред. Д. Гловера. - М .: Мир, 1988. - 538 с.
Маліатіс Т., Фрич Е., Сембрук Дж. Молекулярне клонування. Методи генетичної інженерії. - М.: Мир, 1984. - 463 с.
Методи молекулярної генетики та генної інженерії. Под ред. А.І.----. -
Новосибірськ: Наука, 1990. - 248 с.
Мобільність генома рослин. Под ред. Б. Хол і Е.С. Делінс. - М .:
Агропромиздат, 1990. - 272 с.
Плазміди. Методи. Под ред. Д. Хорда. - М .: Агропромиздат, 1990. - 272 с.
Пехов А.П. Основи плазмідологіі.- М .: 1996. - 231 с.
Сільськогосподарська біотехнологія. Векторні системи молекулярного клонування. Под ред. Р.Л. Подреперс і Д.Т. Денхардт. - М .: Агропромиздат,
1991. - 535 с.
Солова Г.К., Крівопалов Ю.В., Великов В.А., Чумаков М.І. Прикріплення
Agrobacterium до коріння пшениці. // Мікробіологія. 1995. т. 64. №4, с. 526-
530.
Захарченко Н.С., Коміві М.А., Бур'янов Я.І. Індукування процесингу тДНК.
// Фізіологія рослин. 1999. т. 46. № 2, - с. 282-291.
Baker R.F., Idler I.B. and al. Nucleotide sequence of the tDNA region from
Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTi / 5955. Plant Mol. Biol., 1983,
V.2, pp. 335-350.
Douglas C.J and al. Identification and genetic analisys of an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence rigion. J. Bacteriol., 1985, v. 161, pp.
850-860.
Holster S.M., Villaroel and al. An analisys of the boundaries of the octopine TL - DNA intumors induced by Agrobacterium tumefacies. Mol. Gen.
Genet., 1983, v. 190, pp. 35-38.
Howord E.A., Zupan J.R. and al. The vir Dr protein of A. Tumefaciens contaen sal-terminal bipartite nuclear localization sygnal: implication for nuclear uptake of DNA in plant cells. Cell, 1992, v. 68, pp. 109-119.
Janssens A., Engler., Zambryski P. The nopaline c58 tDNA region is teansribed in Agrobacterium tumefaciens., Mol. Gen. Genet., 1984, v. 195, pp. 341-350.
Melchers LS, Hooykaas PJJ, virulence in Agrobacterium tumefaciens.
Oxford Surv. Plant Mol. Cell Biol., 1987. № 4. pp. 167-170.
Stachel S.E., Nester E.W. The genetic and transcriptional organization of the vir regulon of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J., v. 5, pp. 1145-1454.
Zambryski P., Joos N., Genetello G., Leemans. Ti plasmid veefof for the introduction of DNA in to plant cells without alteration of their normal regeneration Capacity. EMBO J., 1983. v. 2, pp. 2143-2150. | |

Сторінки: 1 2 3 4

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар