Реферати » Реферати з біології » Біохімія нуклеїнових кислот

Біохімія нуклеїнових кислот

Д. Г. Кнорре

Новосибірський державний університет

Інформаційний зміст ДНК. Регуляторні райони і інтрони

У попередній статье1 було розказано лише про найголовніше інформаційному змісті ДНК: ДНК містить програми для синтезу властивих даному організму білків, які являють собою послідовності трійок нуклеотидів на транскрібіруемих нитки. Безпосередньо вони програмують синтез відповідного кодону мРНК. Наприклад, майбутній залишок фенілаланіну повинен бути записаний на транскрібіруемих нитки ДНК як (3 ') dAdAdA (5'), якщо програмується ко-дон UUU, або як (3 ') dAdAdG (5'), якщо кодується кодон UUC. Ділянка ДНК, що містить всю інформацію про програмованому білку, називають геном для даного білка. Генами називають і ділянки ДНК, які містять всю необхідну інформацію про структуру РНК (рибосомні і транспортні РНК), а також допоміжні ділянки, необхідні для транскрипції гена. Насправді послідовністю кодують три-нуклеотидів для синтезу білків або послідовністю нуклеотидів, які кодують структуру тРНК або рРНК, у ДНК інформація не вичерпується. Сьогодні вже ясно, що воно незмірно багатшою, а, мабуть, багато чого ще і взагалі невідомо.

Для створення певної РНК необхідно, щоб транскрипція почалася в певній точці величезної молекули ДНК. Тут повинна виявитися і розташуватися за потрібне для транскрипції чином РНК-полімераза. Для цього існує спеціальна область, найчастіше знаходиться перед кодує послідовністю, роль якої полягає в тому, щоб зв'язати й орієнтувати певним чином РНК-полімеразу. Цю область, якщо вона розташована вздовж ланцюга близько від початку старту транскрипції, називають промотором.

Нове несподіване виявилося пов'язаним зі структурою генів еукаріот. З'ясувалося, що смислова послідовність, що кодує певну послідовність амінокислот у білку або певну послідовність нуклеотидів в РНК, необов'язково є безперервною. Вона може містити деякі вставні послідовності, які отримали назву інтронів.

1 Кнорре Д. Г. Біохімія нуклеїнових кислот / / Сорос-ський Освітній Журнал. 1996. № 3. С. 11-16.

Кодуючі послідовності, розділені интронами, в цьому випадку називають екзонами. При транскрипції виходять РНК-копії, які містять і потрібні в кінцевій (зрілої) молекулі РНК фрагменти, і зайві, які повинні бути видалені (вирізані) з зрілої молекули. Кожне таке вирізання має супроводжуватися возз'єднанням решт послідовних екзонів, між якими знаходився Інтрон. Цей процес отримав назву "сплайсинг". Сплайсинг відбувається з вибірковістю, характерної для процесів, що каталізуються ферментами. До відкриття сплайсингу вважалося загальноприйнятим, що всі ферменти мають білкову природу. Проте ніякі білки в деяких випадках в сплайсинге не беруть участь, тобто РНК, що містить інтрони, може сама здійснювати селективну реакцію, причому з досить великою швидкістю. У результаті довелося визнати, що біологічними каталізаторами можуть служити не тільки білки, а й РНК. За аналогією з ензимами такі каталізатори отримали назву рибозимов.

Говорячи про інформаційне змісті ДНК, не можна не сказати про те, що інформаційний зміст ДНК може змінюватися як в результаті помилок при реплікації, так і при дії різних зовнішніх факторів - опромінення та обробки деякими хімічними реагентами. Зміни в структурі ДНК-якого організму носять назву мутацій. Мутація може полягати в тому, що одна пара нуклеотидів у двох ланцюгах перетворюється в іншу комплементарних пару. Це, природно, відбувається не одноразово: спочатку виникає одна помилка, наприклад dC замінюється на dT. При реплікації dT відбере для введення в нову ланцюг dA, а не dG, яке знаходилося в цьому місці ланцюга у батьківського ДНК. У підсумку замість пари dC - dG в дочірній молекулі, а тим самим і у всіх наступних поколіннях на цьому місці буде знаходиться пара dT - dA. Такі мутації отримали назву точкових. Відбуваються і більше значні за масштабом мутації. Часто, хоча далеко не завжди, мутації мають серйозні біологічні наслідки. Відомі, наприклад, гени, які відповідають за контроль над розмноженням клітин, стимулюючи його до певної межі і зупиняючи в потрібній для організму фазі. Деякі поодинокі зміни у такому гені призводять до того, що здатність до контролю за процесом поділу клітин втрачається і ген перетворюється на онкоген, тобто ген, що сприяє необмеженого розмноження клітин - клітини стають злоякісними і виникає ракова пухлина.

Що сучасна хімія і біохімія вміють робити з нуклеїновими кислотами

Хімія і біохімія нуклеїнових кислот не тільки поглибили наші уявлення про величезну групі найважливіших біологічних процесів, пов'язаних із збереженням, розмноженням і використанням спадкової інформації, закладеної в генетичному матеріалі клітин, але дали потужний імпульс для становлення сучасної біотехнології з важливими практичними виходами. Для того щоб не наосліп маніпулювати нуклеїновими кислотами, було необхідно навчитися вивчати їх структуру, насамперед складові їх послідовності нуклеотидів. Вперше ціною воістину героїчних зусиль це було зроблено для декількох тРНК, що складаються з декількох десятків нуклеотидів. Приємно відзначити, що на першому етапі змагання за встановлення первинної структури тРНК в лідируючій п'ятірці була і група радянських вчених, очолювана А.А. Баєв. Проте створені в ході цих робіт методи були настільки трудомісткі, що для прориву у дослідження ДНК і великих молекул РНК вони були непридатні. Революційні рішення, принципово відрізняються як один від одного, так і від перших методів, були знайдені в США Алленом Максамом і Уолтером Гілбертом і в Англії Фредеріком Сенгером. Ці методи, особливо метод Сенгера, зробили можливим секвенування нуклеїнових кислот загальним розміром в мільйони нуклеотидних пар.

Звичайно, в рамках однієї статті розповісти в деталях про ці методи неможливо. Тому доведеться обмежитися викладом найбільш принципових особливостей методу, причому тільки методу Сенгера. Особливістю проблеми є необхідність визначити послідовне розташування дуже великого числа залишків нуклеотидів (за один прохід - кілька сот). Зате властивості кожного залишку вже добре вивчені. Основоположна ідея Сенгера полягала в тому, щоб дослідити послідовність не самою ДНК або, точніше, її досить довгого фрагмента, а досліджувати структуру новосинтезованих ДНК, отриманої на досліджуваній ДНК як матриці за допомогою ДНК-полімерази. Через комплементарності нової ДНК за її послідовності нуклеотидів неважко відновити структуру матриці. При цьому виявилося можливим частково замінити в суміші мономерів, з якої синтезується нова ланцюг, один з них на так званий дідезоксінуклеотід. На рис. 1 наведена хімічна формула нуклеотиду, а саме тімідінфосфата, позначеного символом dT. Залишком фосфорної кислоти він пов'язаний в ланцюзі з попереднім нуклеотидів. Його ОН-група повинна приєднати наступний нуклеотид при продовженні росту ланцюга. Виявилося, що при реплікації можна зробити невеликий обман ДНК-поліме-рази - підмішати до суміші нуклеотидів дідезоксі-

Биохимия нуклеиновых кислот

Рис. 1. Структури тимідин-5'-трифосфату і його дідезоксіаналога

рибонуклеотид, у якого ця ОН-група відсутня. Його можна позначити в представленому випадку символом ddT. З якоюсь імовірністю ДНК-полімераза впізнає і приєднає до зростаючої ланцюга дуже схожий ddT замість dT. Так як синтез йде в суворій відповідності з принципом компле-ментарной, то це відбудеться навпроти тієї точки матричної ДНК, де знаходиться комплементарний dA. Але через відсутність у ddT ОН-групи ця ланцюжок не зможе розвиватися далі, станеться обрив ланцюга. Обрив з певною ймовірністю може відбутися в будь-якій точці навпроти dA. Таким чином, вийде суміш новосинтезованих ланцюгів різної протяжності, причому довжини (числа НУК-леотидной залишків) всіх цих ланцюгів точно відповідають номерам залишків dA матриці. Отже, в такому експерименті визначаються точки розташування всіх залишків dA в досліджуваній ДНК. Якщо три аналогічних експерименту провести з сумішами, що містять домішки інших диде-зоксінуклеотідов: ddA, ddC і ddG, то аналогічно будуть розставлені по номерах всі інші три нуклеотиду на досліджуваної ДНК. Розділити ж отримані суміші по довжинах не представляє праці за допомогою електрофорезу - методу, заснованого на переміщенні заряджених молекул під дією постійного електричного поля. Справа в тому, що кожен залишок нуклеотиду містить залишок фосфорної кислоти, який несе негативний заряд. Тому, будучи поміщені в електричне поле, фрагменти різної довжини будуть переміщатися до анода з різними швидкостями. Так як електрофорез зазвичай проводять в дуже вузький середовищі (гелі), то ця середу чинить опір переміщенню фрагментів, тим більшу, чим більше розміром фрагмент. Цей фактор пересилює дію поля, тому, чим довше фрагмент, тим повільніше він рухається, але всі вони розташовуються в порядку, відповідному їх довжинам. Залишається тільки "побачити" місце кожного фрагмента. Досі для цієї мети найчастіше використовують радіоактивну мітку: у нуклеотиди, з яких синтезується нова ланцюг, вводять радіоактивний фосфор. Тому після закінчення гель-електрофорезу гель прикладають до рентгенівській плівці і на місці знаходження фрагментів після прояву радіоавтографа з'являються темні плями. На рис. 2 схематично показані такий радіоавтограф і читається з нього послідовність маленького шматочка ДНК.

Биохимия нуклеиновых кислот

Рис. 2. Схема методу Сенгера і схематичне уявлення фрагмента радіоавтографа гелю з відповідною йому послідовністю НУК-леотідов.Хі X-произвольныекомплементарные залишки нуклеотидів. Пронумеровані індексами залишки, що входили до складу праймера. dA - залишки дезоксіаденозінового нуклеотиду у складі аналізованої ДНК. dT і ddT - залишки тимідин монофосфату і дідезоксітімідін монофосфату, які включилися в нові ланцюги ДНК, отримані при реплікації за допомогою ДНК-полімерази

Слід зазначити, що метод Сенгера, так само як і метод Максама-Гілберта, які вчинили революцію у вивченні структури ДНК, виявився успішним завдяки порушення основного канону аналітичної хімії, який можна сформулювати так: якщо не можна безпосередньо визначити структуру деякої молекули, потрібно її кількісно перетворити на іншу молекулу, будова якої відомо. На

Сторінки: 1 2 3