Реферати » Реферати з біології » Біохімія нуклеїнових кислот

Біохімія нуклеїнових кислот

цьому принципі побудований і чудовий метод Едмана для встановлення послідовності амінокислот у поліпептиду (фрагментах білків). Автор знайшов хімічну реакцію, яка дозволяє отщепить з одного, певного кінця поліпептиду один залишок амінокислоти, перетворивши його в так званий тиогидантоинами і не руйнуючи при цьому решту ланцюжок. Різним амінокислотам відповідають різні тиогидантоинами, так що легко визначити, яка саме з 20 амінокислот, що входять до складу білків, була відщеплена. Укорочений на одну амінокислоту поліпептид може бути повторно використаний для визначення природи наступного амінокислотного залишку. Однак кожен знайдений амінокислотний залишок - результат окремої процедури, і таким шляхом в кращих випадках вдається виконати кілька десятків кроків. У методі Сенгера аналізується складна суміш продуктів реплікації, так що з одного гелю (точніше, з чотирьох доріжок одного гелю) відразу розставляються по своїх місцях сотні нуклеотид-них залишків.

Успішно розвинені і методи хімічного синтезу великих фрагментів нуклеїнових кислот - оліго-нуклеотидів. Як і у випадку секвенування, все почалося з надзвичайно трудомістких методів. Розробивши і застосувавши на практиці ці методи, американський учений Гобинд Корану в 1970 році завершив синтез ДНК, що кодує послідовність однією з тРНК дріжджів, специфічної до амінокислоті аланину. Однак з процедури, яка вимагала багаторічної праці великої кількості фахівців вищої експериментальної кваліфікації, в рутинний метод, що виконується на спеціальних автоматичних синтезаторах, синтез перетворився істотно пізніше. Це було пов'язано як зі зміною хімічних процесів, покладених в основу послідовного приєднання до зростаючої ланцюга необхідних нуклеотидів, так і у величезній мірі з введенням в практику так званого твердофазного синтезу, загальний принцип якого був запропонований американським вченим Робертом Мер-ріфілдом для синтезу білків з амінокислот .

Як в білках, так і в нуклеїнових кислотах зв'язку між мономірні ланками, скільки б їх не було, ідентичні. У нуклеїнових кислотах це завжди зв'язок між залишком фосфорної кислоти, що належить одному ланці мономеру, і гідро-ксільной групою (ОН) сусіднього мономеру. Щоб побудувати, наприклад, фрагмент нуклеїнової кислоти довжиною в 100 нуклеотидів, потрібно послідовно 99 раз здійснити реакцію утворення цьому зв'язку, по черзі вводячи в реакцію один мономер за іншим. Сьогодні проблеми освіти такого зв'язку в хімії, можна сказати, не існує. Питання в тому, щоб кожен раз проводити цю реакцію як можна більш кількісно і з мінімальним накопиченням непотрібних (побічних) вществ. Хімік вважає, що, провівши реакцію з виходом 80%, він має непоганий результат. Але загальний вихід стостадійного процесу при виході 80% на кожну стадію складе 0,8100 = 10 ~ 9, тобто одну мільярдну частину від введеного в реакцію першого нуклеотиду. Очевидно, що такий вихід не може бути основою для прогресивної технології. Тим часом, принаймні частково, некількісні виходи відбуваються від того, що за хімічними традиціям при проведенні реакції в декілька стадій потрібно після кожної стадії виділити отриманий продукт, очистити його від не вступили в хімічну реакцію реагентів, від інших домішок і тільки потім приступати до наступної стадії. Втрати, причому цілком відчутні, на кожній стадії неминучі.

Мерріфілд запропонував відмовитися від цієї класичної хімічної традиції. Згідно з його ідеєю, перша ланка створюваної ланцюга полімеру міцно, до самого кінця синтезу, закріплюється хімічним зв'язком на твердому речовині-носії, який поміщається в спеціальну трубку-реактор (колонку). Через реактор пропускається другу мономер, причому в достатній надлишку, щоб перетворення закріпленого мономеру було якомога більш повним. Потім надлишок другого мономера і всі допоміжні речовини, потрібні для утворення хімічного зв'язку між мономерами, відмиваються пропусканням через реактор відповідного розчинника. Заодно відмиваються і побічні речовини, принаймні ті, які не пов'язані з носієм. Після цього приступають до приєднання третьої ланки. Процедуру можна повторювати багато разів, хоча, звичайно, і не до нескінченності - якісь втрати і забруднення неминучі. Ясно, що така процедура легко піддається автоматизації. Синтезатор оліго-нуклеотидів (іноді його називають ген-синтезатором) має кілька посудин, що містять окремі мономери, допоміжні речовини, потрібні для синтезу, і розчинники для проміжних промивок реактора. Всі ці речовини подаються по черзі в реактор, що містить носій і зростаючу на ньому полімерну ланцюг за допомогою насоса, який вибирає кожен раз потрібний посудину по введеної в прилад програмі. У програму вводиться і та послідовність, яку слід синтезувати. Цим задається структура майбутнього продукту. Залишається тільки після закінчення синтезу зруйнувати хімічну зв'язок, за допомогою якої перша мономерна ланка було закріплено на носії, і провести очищення синтезованого продукту від неминуче накопичилися домішок. В умілих руках на надійно працюють ген-синтезаторах вдається отримувати фрагменти довжиною до ста нуклеотидів і більше. Звичайно ж, біологічно цікаві гени значно довшим. Проте вже на зорі становлення штучного синтезу нуклеїнових кислот Корану розробив спосіб з'єднання досить довгих олигонуклеотидов між собою за допомогою існуючого у всіх живих організмів ферменту ДНК-лігази. Так що в даний час синтез генів є хоча і трудомісткою, але цілком доступною процедурою.

Чудовою здатністю ДНК є можливість її розмноження. В принципі для цього потрібні лише належним чином підготовлені нуклеотиди і ДНК-полімераза. Тому, отримавши деякий невеликий кількість ДНК, її можна розмножити. В даний час ця процедура для невеликих молекул ДНК або певних шматків великий молекули добре розроблена. Вона отримала назву ампліфікації, або полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Є лише одна осложняющая, але без особливої ??праці переборна проблема. Справа в тому, що особливістю всіх відомих ДНК-полімерази є їх нездатність почати синтез нових полімерних ланцюгів. Вони можуть тільки подовжувати вже існуючу ланцюг, пов'язану з комплементарної матрицею.

У живих організмах ця трудність долається досить складним чином. Коли приходить час для подвоєння ядерної або бактеріальної ДНК, вступає в дію спеціальний фермент, що вибирає певні ділянки ДНК, з яких повинна початися реплікація, і синтезує на них короткі затравочние фрагменти РНК - прай-заходи. Фермент, по суті справи, є РНК-полі-Мераз, але виконує спеціальну функцію. Його часто називають ДНК-праймазой. Після утворення праймера ДНК-полімераза продовжує зростання ланцюга вже за допомогою дезоксірібонуклеотідов. Таким чином, спочатку утворюється ДНК, що несе на 5'-кінці невеликий фрагмент РНК:

Биохимия нуклеиновых кислот

З нездатності ДНК-полімерази починати синтез нових ланцюгів ДНК випливає, що для здійснення ПЛР крім ДНК-полімерази і мономерів необхідні праймери . Якщо мова йде про ампліфікації певної ділянки ДНК, то досить ввести в систему праймери, комплементарні 3'-кінців обраних ділянок обох ниток. Це роблять при помірній температурі, щоб дуплекс матриці з праймером був досить міцним. Після проведення синтезу дочірніх копій обраного ділянки нові дуплекси руйнують нагріванням до досить високої температури, щоб розвести вихідну і новосинтезовані нитки, потім знову охолоджують до температури, яка сприяла утворенню дуплексів з праймером і подальшої реплікації. Ясно, що при кожному такому циклі кількість копій ампліфіціруемого ділянки подвоюється, тобто за 20 циклів можна збільшити кількість цікавить дослідника послідовностей в 220 = 106 разів.

Серед численних застосувань ПЛР слід в першу чергу відзначити, що вона знайшла застосування для виявлення мутантних генів, що має величезне практичне значення для виявлення успадкованих захворювань. При проведенні ПЛР при цьому вводяться такі праймери, щоб вони допомогли йому простимулювати амплификацию му-тантний гена, але не дали можливість амплифици-ровать незмінений ген. Якщо виявляється мутація присутня, то на останній стадії ампліфікації на тлі різноманітних фрагментів ДНК, що не піддалися ампліфікації, вийде велика кількість мутантного фрагмента, який легко виявити і визначити, що це саме шуканий фрагмент, оскільки він має певний заздалегідь відомий розмір. При наявності хороших реактивів і приладів вдається зареєструвати спочатку незначні кількості певній послідовності. ПЛР дозволяє проводити такі тонкі аналізи, як пренатальну діагностику - визначення небажаної послідовності у плода на перших тижнях вагітності. Залежно від характеру захворювання, провоцируемого таким мутантним геном, можна або прийняти спеціальні заходи для нейтралізації негативного ефекту, що викликається цим геном, або в деяких не піддаються профілактиці випадках рекомендувати жінці своєчасно позбутися дефектного плоду і тим самим запобігти появі дефектного дитини.

Можливість хімічно синтезувати, а також направлено вирізати з природних ДНК різні гени привела до народження нової галузі біотехнології - генної інженерії. З'явилися методи, що дозволили вставляти довільні гени в невеликі молекули ДНК, здатні всередині певних клітин автономно розмножуватися, або самокопіюватися синхронно з реплікацією клітинної ДНК. З'явилася можливість вбудувати ген, не властивий даному організму, в спадкові структури цього організму. А оскільки ген може програмувати освіта кодованого їм продукту - білка або РНК, - то такий організм може почати виробляти невластивий йому продукт. Виявилося можливим виробляти в клітинах бактерій потрібні людині або якого-небудь важливого для сільського господарства тварині білки. Одним з найбільш вражаючих прикладів є організація генноїнженерного виробництва людського інсуліну. Це надзвичайно важливий гормон, вироблений підшлунковою залозою і абсолютно необхідний для засвоєння цукру. Недолік, а тим більше повна відсутність інсуліну призводять до найтяжчого і широко розповсюдженому захворюванню - діабету. Основним засобом порятунку діабетиків є щоденне введення інсуліну. Більша частина хворих може користуватися бичачим інсуліном, який добувають з підшлункової залози великої рогатої худоби на м'ясокомбінатах. Однак існують багато десятків тисяч діабетиків, які не можуть використовувати чужорідний інсулін, дещо відрізняється за структурою від людського. Створення гена людського

Сторінки: 1 2 3

енциклопедія  з сиру  аджапсандалі  ананаси  узвар